[发明专利]南方大口鲶肌肉细胞系的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用南方大口鲶肌肉组织建立肌细胞系的方法，具体地指一种南方大口鲶肌细胞系的构建方法。

背景技术

南方大口鲶是重要的大型经济鱼类，天然分布于我国长江以南的各大江河水域中，具有肉质细嫩、味道鲜美、适应性强、生长速度快、养殖周期短和市场前景好等特点，是极好的水产优良养殖品种之一，推广养殖前景广阔。但随着水环境污染的日益加剧，水体中的各种环境污染物，包括诱变剂、致癌物、环境激素、基因毒物和吧、内分泌干扰物等对水产养殖和人类健康的威胁愈来愈大。利用鱼类细胞培养进行环境污染监测和安全性评价，是鱼类细胞培养的重要用途之一。建立南方大口鲶的组织细胞系，能为环境毒理学研究提供良好的实验材料，针对性的检测水体存在的各种环境污染物对南方大口鲶的影响，并研究污染物对南方大口鲶细胞的作用机理，促进水产养殖业的持续健康发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是利用南方大口鲶肌肉组织，提供了一种南方大口鲶肌细胞系的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种南方大口鲶肌细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1)首先将体质健康的南方大口鲶置于含有浓度为1000单位/mL的青霉素和链霉素的水溶液中饲养36～60h，

2)取出南方大口鲶置于体积分数为75％的酒精中浸泡1～2min后，在超净工作台内无菌剪下背肌，并将背肌置于AIM培养基中浸泡2～3h，其中，25～35min更换一次AIM培养基，

3)将步骤2)浸泡的背肌用眼科剪剪碎成1mm³的小块，然后用AIM培养基冲洗2～3次，收集20～25个组织小块贴到25cm²的原代细胞培养瓶底部，在室温下干贴2～4h后，将培养瓶侧放半小时后，吸出过多的培养液，每个培养瓶中缓慢注入4～6mL升的南方大口鲶肌细胞增殖培养液，在22～25℃生化培养箱中培养，观察并记录培养情况，每隔2～3天用移液管吸出旧的培养基，并离心，然后吸出2～3mL的上清液再加上2～3mL的南方大口鲶肌细胞增殖培养液；即得到南方大口鲶肌细胞系。

在上述方法中，所述步骤1)中，每mL水溶液中，青霉素和链霉素含量的比例为1∶1～3。

在上述方法中，所述AIM培养基为含有500U/mL青霉素、500μg/mL链霉素、12.5μg/mL两性霉素B和250μg/mL庆大霉素的2×MEM培养基。

在上述方法中，所述南方大口鲶肌细胞增殖培养液配方是以MEM培养基为基础，添加了20％胎牛血清、0.2μg/mL表皮生长因子和25ng/mL成纤维生长因子，培养液的pH为7.2～7.4

在适合的条件下南方大口鲶肌细胞系可以进行传代培养，传代培养的步骤：

1)南方大口鲶肌细胞系待南方大口鲶肌肉细胞长成单层后，吸出培养瓶中的旧培养液，并将旧培养液离心，然后向培养瓶中加入2～3mL质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液；在倒置显微镜下观察细胞消化情况，待80％细胞收缩变圆时，在超净工作台内加入南方大口鲶肌细胞增殖培养基上清液来中和胰蛋白酶，并用移液管反复吹打细胞瓶底，使细胞分散制成细胞悬液；

2)将步骤1)制备得到的细胞悬液在1000～2000转/min条件下离心7min，用6～8mL南方大口鲶肌细胞增殖培养基重悬细胞沉淀，并分装于2个培养瓶中，最后向每个培养瓶补加2～3mL旧培养液上清液，待南方大口鲶肌肉条细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。

本发明构建的南方大口鲶肌细胞系现已传至第56代。在条件合适情况下可以无限传代。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的细胞系具有连续传代特点，能提供大量的南方大口鲶肌肉细胞；可直接应用于环境毒理学以及相关基础研究。

2、组织块消毒灭菌效果好。由于南方大口鲶活鱼体组织表面有大量的细菌和真菌，组织块消毒灭菌的效果是决定组织细胞培养成败的关键。用上述AIM培养基浸泡的方法来进行消毒灭菌，既可有效地杀灭组织表面的细菌和真菌，又可以避免对组织的损伤，最大限度地保持组织的活力。

3、组织块贴壁生长良好。

4、本发明操作简便易行，无需特殊设备，在一般的无菌培养室内均可操作。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1