[发明专利]一种PAGE的高效银染方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种适用于聚丙烯酰氨凝胶的高效银染方法。

背景技术

聚丙烯酰氨凝胶电泳是目前常用的检测DNA的方法，其分辨率好，能检测出DNA片段间甚至1bp大小的差异，且通量高，可以在样品量较少的情况下进行大批量的检测。银染法凭借其毒性轻、污染小等优点，是聚丙烯酰氨凝胶电泳中常用的一种染色方法。

该染色技术的首次应用是在蛋白的检测上(Switzer et al.1979)，随后该技术被广泛的应用在核酸的检测上(Guo et al.2008)。如今随着数量性状的遗传定位、遗传图谱的构建、关联分析等研究的快速发展，越来越多的核酸片段需要银染法来染色检测(Liang et al.2014)。然而传统的银染方法往往药品配置复杂、过程繁琐、所需时间较长。

本发明优化了各个处理液的配方，且在不影响检测灵敏度的基础上大幅缩短了银染所需时间，提高了实验效率。

发明内容

本发明的目的是提供一套适用于聚丙烯酰氨凝胶的高效银染方法。

根据本发明的方法，通过配制固定液、渗透液和显色液中主要药品的不同浓度，对聚丙烯酰胺凝胶银染方法中各个药品的最适浓度进行了探讨和改良。并经过大量的实验，摸索出了在不影响染色质量的情况下三种处理液的较短处理时间，显著提高了实验效率。

根据本发明的适用于聚丙烯酰氨凝胶的银染方法包括以下步骤：

1)聚丙烯酰氨凝胶电泳结束后，取下凝胶，浸泡在固定液中，处理2分钟，所述固定液的配方为：10％体积比乙醇；1.0％体积比乙酸；

2)随后取出凝胶，迅速放至水中，清洗20秒；把凝胶取出放入0.2wt％，AgNO₃渗透液中处理3分钟，取出凝胶，迅速放至水中，清洗20秒；

3)把凝胶放进显色液中，2分钟即可显色，所述显色液配方为2wt％NaOH；20mL37v％HCOH/L；0.0175wt‰Na₂S₂O₃。

根据本发明的具体实施方式，所述方法包括以下步骤：

1)棉花基因组DNA的提取

把棉花种子浸泡于温水中过夜，随后沙培于光照培养箱内，培养一周左右至新鲜叶片展开，选取鲜嫩叶片0.5g在液氮中迅速碾磨至微白粉末，提取方法按照高含量酚的CTAB法，并稍作改进。提取的DNA浓度和质量分别用0.8％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定。把DNA原液稀释至适宜浓度后放至‐20℃保存备用。

2)PCR扩增反应和聚丙烯酰氨凝胶电泳

PCR扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性40s，55℃退火45s(不同引物退火温度有稍微区别)，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

8％的聚丙烯酰氨凝胶电泳检测：采用BIO‐RAD公司的Power1000型电泳仪，PROTEAN Ⅱ Ⅺ Cell电泳槽装置。在扩增产物中加入0.5倍体积的上样缓冲液，采用8％的聚丙烯酰胺凝胶检测产物。

3)聚丙烯酰胺凝胶的银染

聚丙烯酰氨凝胶电泳结束后，取下凝胶，浸泡在固定液(10％Ethanol；1.0％Acetic acid)中，处理2分钟，当固定液中含有乙醇时，条带与凝胶的对比度有少量改善，条带更加明显(图1)，乙酸含量的稍微改变对凝胶显色结果影响微乎其微；随后取出凝胶，迅速放至水中，清洗20秒；把凝胶取出放入渗透液(0.2％AgNO₃)中处理2分钟，当银离子浓度为0.2％时，渗透处理2-3min即可达到较好的效果，银离子浓度减低时需适当加长渗透时间，当银离子浓度达到0.3％或更高时，凝胶整体背景变深(图2)；取出凝胶，迅速放至水中，清洗20秒；最后，把凝胶放进显色液(2％NaOH；20mL 37％HCOH/L；0.0175‰Na₂S₂O₃)中，3分钟即可显色，显色结果理想。当氢氧化钠浓度小于1％时，凝胶底色开始明显加重，条带与底色的对比度降低，且随着氢氧化钠浓度的降低，这种现象越严重。较高的氢氧化钠浓度对实验结果的影响不是很大。甲醛(37％)的浓度过低时会导致条带不明显，处理时间加长，且会导致凝胶背景变暗红，当浓度大于15mL 37％HCOH/L时，显色效果理想，在120转/分钟的晃动下3min中即可得到很好的显色结果(图3)。所有处理过程都在120转/分钟的摇床上处理。处理中晃动频率的降低会延缓实验时间。