[发明专利]一种胶孢炭疽菌的快速产孢方法

说明书

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，具体涉及一种胶孢炭疽菌的快速产孢方法，适用于干燥保存、活化的等状态下的胶孢炭疽菌的菌丝体的快速产孢，通常在24～48 h内即可迅速产孢，每平方厘米的孢子量可达7.8×10⁷ ~ 6.5×10⁹个。

背景技术

胶孢炭疽菌寄主范围十分广泛，可侵染桃、油桃、苹果、葡萄、芒果和梨等多种寄主引起炭疽病。胶孢炭疽菌菌株间从形态特征、致病性、分子遗传水平、营养体亲和群等方面都具有较大的变异，菌落可为灰白色至深灰色，气生菌丝平坦，毡状或者絮状，分生孢子梗一般为无色，分生孢子为单胞，淡黄褐色，圆筒形或棍棒形，两端钝圆形，大小通常为12～26 μm×3.5～5 μm。关于胶孢炭疽菌孢子的研究极为普遍，它对炭疽菌的分类、致病性等的研究极为重要，而诱导产孢则成为研究中的一个关键环节，如何快速获得大量孢子在很大程度上决定着研究的进展及成败。

发明内容

本发明的目的是利用简易可行的方法快速诱导胶孢炭疽菌菌丝体产孢，从而为加快后续的孢子、附着胞及致病性的相关研究奠定良好基础，并为广大科研工作节约了大量的宝贵时间。

为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：

以PDA固体培养基培养的胶孢炭疽菌的菌丝体为产孢的基础，通过刮菌丝、无菌水冲洗、干燥及光照培养措施诱导菌丝体在光照24～48 h条件下迅速萌发大量孢子。

具体包括以下步骤：

（1）将分离或已活化的胶孢炭疽菌重新转接到PDA平板上，置于28℃恒温培养箱中光照培养24～48 h；

（2）待菌落长至直径为3～4.5cm时，在超净工作台中用无菌棉签将中央的直径为2~3.5cm气生菌丝除去，并用无菌水将表面冲洗干净，倒扣自然晾干；

（3）将晾干后的平板盖上盖子后平铺于28 ℃的恒温培养箱中继续光照培养24~48 h；

（4）光照24~48 h后即在平板表面看见橙红色的分生孢子器，用无菌水将分生孢子器洗下并将其挤破，分生孢子则自动释放到水中；定容至20 mL，取20 μL至血球计数板上观察并计算单位面积的产孢量。

PDA固体培养基配方：马铃薯200g ，葡萄糖20 g，琼脂20 g，定容至1 L。

一般光照24h后即可在平板表面看见少量橙红色的分生孢子器，用无菌水将分生孢子器洗下并将其挤破，分生孢子则自动释放到水中；光照48h后分生孢子器明显增多，用适量无菌水将所有分生孢子器洗下后定容至20mL，取20μL至血球计数板上观察并计算单位面积的产孢量。

所述的胶孢炭疽产孢量达7.8×10⁷ ~ 6.5×10⁹个/cm²。

本发明的有益效果是：通过光照刺激使胶孢炭疽菌菌丝体在24～48h内即可快速产生大量分生孢大器和分生孢子，大大缩短了整个实验周期，有效节约了人力物力及科研工作者的大量宝贵时间。

具体实施方式

实施例1

（1）将分离的胶孢炭疽菌重新转接到PDA平板上，置于28 ℃恒温培养箱中光照培养24 h；

（2）待菌落长至直径约为3 cm时，在超净工作台中用无菌棉签将中央的直径为2 cm气生菌丝除去，并用无菌水将表面冲洗3次，倒扣自然晾干；

（3）将晾干后的平板盖上盖子后平铺于28 ℃的恒温培养箱中继续光照培养24 h左右；

（4）光照24 h后即在平板表面看见少量橙红色的分生孢子器，用无菌水将分生孢子器洗下并将其捣破，分生孢子则自动释放到水中，定容至20 mL，取20 μL至血球计数板上观察并计算单位面积的产孢量。

所述的胶孢炭疽产孢量达7.8×10⁷个/cm²。

实施例2

（1）将已活化的胶孢炭疽菌重新转接到PDA平板上，置于28 ℃恒温培养箱中光照培养48 h；

（2）待菌落长至直径为4.5 cm时，在超净工作台中用无菌棉签将中央的直径为3.5 cm气生菌丝除去，并用无菌水将表面冲洗干净，倒扣自然晾干；

（3）将晾干后的平板盖上盖子后平铺于28 ℃的恒温培养箱中继续光照培养48 h；

（4）光照48 h后即在平板表面看见橙红色的分生孢子器，用无菌水将分生孢子器洗下并将其捣破，分生孢子则自动释放到水中，定容至20 mL，取20 μL至血球计数板上观察并计算单位面积的产孢量。