[发明专利]一种多胎羊的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体是一种多胎羊的检测方法。

背景技术

绵羊育种主要是改善其生长和繁殖性状。迄今为止已发现了一些控制这些生长和繁殖性状的基因，比如，BMPR-IB、BMP15和GDF9已被确认为绵羊的高繁殖力主效基因；黑素皮质素受体-4(melanocortin-4receptor，MC4R)是一类G-蛋白偶联受体，主要在下丘脑表达，在体重、能量平稳和采食量的调控中发挥重要作用；钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)是钙蛋白酶系统的主要成员之一，它是钙激活蛋白酶的抑制因子，可以通过激活钙蛋白酶或降低钙蛋白酶抑制蛋白的活性来提高肌肉的嫩度，改善肉质。

随着分子遗传学的发展，利用分子标记辅助选择育种技术可以快速提高一些单胎品种双胎率，或者提高其胎产羔数，从而大幅度提高其繁殖力。分子标记辅助选择是通过分子生物学技术直接分析DNA分子的一些突变位点，可以准确判断基因型，而且不受时间的限制，可以做到早期选择。

目前检测DNA突变位点的方法一般采用限制性片段长度多态性技术和单链构象多态性技术，这两种方法依靠肉眼进行结果的观察，有时会出现判断错误，从而影响检测结果的可靠性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多胎羊的检测方法，利用连接酶检测反应技术及生物信息学技术，检测绵羊繁殖候选基因在绵羊中的多态性，从而判断出多胎羊。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种多胎羊的检测方法，具体步骤如下：

(1)DNA的提取：从羊的颈静脉采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混匀后-20℃冻存后，采用细胞裂解和蛋白去除液从冻存的抗凝全血中得到基因组DNA；

(2)引物和探针的设计：根据基因序列设计引物，同时根据LDR探针设计原则设计探针；

(3)PCR-LDR反应，分为PCR反应和LDR反应；

(4)数据分析和基因分型：取1μL LDR连接产物与1μL ABI GS 500 ROX荧光标记分子量标准和1μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2min，冰中骤冷，于含有5mol/L尿素的5％聚丙烯酰胺凝胶中电泳2.5h，进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；进行数据分析和基因分型。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)还包括采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。

作为本发明进一步的方案：所述PCR反应包括以下小步骤：

1)准备20uL体系PCR Master Mix

在1.5ml离心管中分别加入10×PCR-buffer200ul，100mM Mg²⁺60ul，20mM/each dNTP 200ul，5U/ul Taq酶20ul，4×Q-solution400ul，5pM primer40ul，最后加入980ul去离子水，充分混匀后离心，再取19ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入1ul基因组DNA；

2)将PCR反应管放入PCR仪进行反应，反应程序为：95℃变性15m，35个循环，每个循环有3个温度，94℃30s，56℃1m，72℃1m，最后在72℃延伸7m；

3)反应结束后，取2μl反应产物在3.0％琼脂糖胶，0.5×TBE中电泳，检测反应是否成功；

4)剩余样品保存于-20℃。

作为本发明进一步的方案：所述LDR反应包括以下小步骤：

1)准备10ul体系连接反应Mix

在PCR反应产物中加入等体积ddH2O稀释，作为连接反应的模板；

2)在1.5ml离心管中分别加入10×buffer100ul，100ul Probe Mix，5ul连接酶，695ul去离子水，充分混匀后离心，再取9ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入1ulPCR反应产物；

3)将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应，反应程序为：95℃变性2m，35个循环，每个循环有2个温度，94℃30s，50℃2m。

作为本发明进一步的方案：所述基因序列包括但不限于BMPR-IB基因、BMP15基因、GDF9基因、MC4R基因和CAST基因。

作为本发明进一步的方案：所述方法还包括卡方检验、遗传参数和最小二乘方差分析。