[发明专利]一种新型下调miRNA-21表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，涉及一种新型下调miRNA-21表达的方法。

背景技术

微小RNA-21(microRNA-21，miR-21)是miRNA家族中的成员之一，具有重要的生物学功能。目前，通过改变miR-21的活性或表达，从而研究其生物学功能的方法主要有抑制剂(Inhibitor)、拮抗剂(Antagomir)及慢病毒载体等。然而，这些方法存在有效作用时间短、操作困难、安全性能差等缺点，难以达到长效、便捷下调miR-21表达的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型下调miRNA-21表达的方法，解决了现有的改变miRNA-21表达的方法有效作用时间短、操作困难的问题。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：miR-21-ASO序列设计：在miRBase数据库中检索出>miR-21-5p的序列：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’；其反义互补序列为：5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’，再与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链；

步骤2：pcDNA-6.2-miR-21-ASO载体构建：将合成的正反义链混合，95℃加热5分钟退火形成双链，将退火的双链DNA室温连接30分钟得到连接产物；

步骤3：取2-10μl连接产物转化100μl感受态细胞DH5α，涂LB平板，含50μg/ml壮观霉素，37℃孵育16小时，取6个阳性克隆，接种到含50μg/ml壮观霉素的LB培养基中，按天根质粒小提试剂盒方法抽提质粒，重组质粒即为pcDNA-6.2-miRNA-21-ASO。

本发明的有益效果是不仅可以长效、便捷下调miR-21的表达，同时还可快捷地观察miR-21下调表达后的生物学效应。

附图说明

图1是本发明中miR-21-ASO序列的设计原理图；

图2是pcDNA-6.2-miRNA-21-ASO真核表达载体构建示意图；

图3是该表达载体构建过程中的质粒电泳图和测序结果；

图4是该表达载体转染真核细胞后，miR-21表达水平检测；

图5是该表达载体转染真核细胞后，miR-21生物学效应检测。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明利用分子克隆及反义核酸技术构建含CMV启动子的pcDNA-6.2-miR-21-ASO真核表达载体。该载体体外转染真核细胞后，利用荧光定量PCR技术检测miR-21的表达，同时通过体外实验观察miR-21下调后的生物学效应。本发明属于生物技术领域，可以广泛用于分子生物学和细胞生物学实验中下调miR-21，并观察其生物学效应。

本发明采用以下步骤进行：

步骤1：miR-21-ASO序列设计：在miRBase数据库中检索出>miR-21-5p的序列：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’；其反义互补序列为：5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’，再与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链。图1为miR-21-ASO序列的设计过程。

步骤2：pcDNA-6.2-miR-21-ASO载体构建：将合成的正反义链混合，95℃加热5分钟退火形成双链。将退火的双链DNA室温连接30分钟得到连接产物，pcDNA-6.2-miRNA-21-ASO的真核表达载体构建完成。图2为pcDNA-6.2-miRNA-21-ASO真核表达载体构建过程。其中，图中：SV40，猴空泡病毒40(Simianvirus 40)；EGFP，增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein)；Spec，壮观霉素抗性(Spectinomycin resistance)；BSD，杀稻瘟菌素抗性(Blasticidin resistance)；Puc Ori,复制起始位点(origin ofreplication)；Pcmv，人巨细胞病毒启动子(Human cytomegalovirus promoter)。