[发明专利]基于硼酸荧光探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于糖蛋白检测技术领域，具体涉及一种基于硼酸荧光探针的分子印迹聚合物微球对糖蛋白的检测方法。

背景技术

糖蛋白是一类重要的翻译后修饰蛋白，在分子识别、细胞内和细胞间信号传导和免疫响应等方面发挥着重要的作用。人体免疫系统中几乎所有参与先天免疫和适应性免疫的关键分子都是糖基化蛋白。蛋白质糖基化的异常是一些肿瘤性疾病发生、发展和转移过程的元凶，当肿瘤性疾病发生时，细胞表面的糖蛋白过量表达。而一些糖蛋白，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)，已经作为临床上用来检测癌症的标记物。因此，研究糖蛋白具有重要的生理学意义和临床价值，对了解生命过程具有至关重要的作用。然而在糖蛋白组学研究中，所面临的样品都是成分非常复杂的生物样品体系，如血液、唾液、尿样、组织细胞等，而大部分的糖蛋白的表达丰度都比较低，往往伴随着许多高丰度的非糖蛋白。为了研究其中的糖蛋白，需要首先对这些糖蛋白进行富集分离。另外，传统的质谱、色谱和电泳等检测方法在检测之前需对生物样品进行处理，而该过程极其容易破坏蛋白等生物分子并且耗时过长，因此，需发展一种非破坏性、高灵敏度且快速的检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术对糖蛋白检测所存在的不足，提供一种基于硼酸荧光探针，以指定糖蛋白为模板的分子印迹微球对糖蛋白的荧光检测方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合氨基

将单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球在弱酸性条件下水解，得到表面为羟基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，将此微球分散于无水乙醇中，加入氨水与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为1:10～20的混合液，表面为羟基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量-体积比为1g:20～40mL，超声分散均匀，室温搅拌12小时，得到表面键合氨基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

2、单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合硼酸荧光探针

将步骤1得到的表面键合氨基的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球分散于无水乙醇中，依次加入2-(4-二羟基硼)苯基-4-羧基喹啉、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，表面键合氨基的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与2-(4-二羟基硼)苯基-4-羧基喹啉、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.8～1.2:0.8～1.2:0.4～0.6，超声分散均匀，40℃搅拌5～10小时，得到表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

3、制备具有荧光特性的指定糖蛋白分子印迹微球

将步骤2得到的表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球和指定糖蛋白加入pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，混合均匀，密封，室温孵育3小时，所得产物与过硫酸铵、苯胺在室温条件下搅拌1～4小时，其中表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球和指定糖蛋白、过硫酸铵、苯胺的质量比为1:0.005～0.015:0.5～2:1～4，得到具有荧光特性的指定糖蛋白分子印迹微球。

4、荧光法检测待测样品

将步骤3得到的具有荧光特性的指定糖蛋白分子印迹微球分散于pH值为5.5～9.5的磷酸盐缓冲液中，配制成0.1mg/mL的指定糖蛋白分子印迹微球分散液，向该分散液中加入指定糖蛋白标准样品，用荧光光谱仪测量不同浓度下指定糖蛋白对应体系的荧光强度，绘制荧光强度随指定糖蛋白浓度的对数值变化的标准曲线；按照上述方法用荧光光谱仪测量待测样品的荧光强度，根据待测样品的荧光强度，结合标准曲线的线性方程即可确定待测样品中指定糖蛋白的浓度。

上述的步骤3中，优选表面键合硼酸荧光探针的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球和指定糖蛋白、过硫酸铵、苯胺的质量比为1:0.01:1:1.5。

上述的步骤4中，所述的磷酸盐缓冲液的pH值最佳为7.5。

上述的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球根据公开号为CN102382273A、发明名称为“17β-雌二醇分子印迹复合微球的制备方法”的发明专利申请公开的方法制备得到；2-(4-二羟基硼)苯基-4-羧基喹啉由百灵威试剂公司(北京)提供，CAS：373384-17-9。