[发明专利]浙白术PCR鉴定试剂盒及鉴定方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种DNA分子鉴定方法，特别涉及中药浙白术PCR鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。

(二)背景技术

白术是为菊科植物白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根茎，在临床上应用广泛，俗有“十方九术”、“北参南术”之称，具有治脾益气，燥湿利水，止汗安胎的功效。浙江是白术的主产区，有上百年的栽培历史。浙江磐安、新昌、嵊县、东阳等地所产品种称为“浙白术”(Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)，为著名的道地药材“浙八味”之一，其特点为术形较为丰满，“术腿”粗短，“云头”膨大。

近年来,由于白术市场的不断扩大，种植户应用的种质混杂和种植方法不规范，商家以次充好等原因，使辨析白术品种及其真伪较为困难，导致了白术成药质量的降低。目前白术品种的鉴定方法主要包括外观形态观察，利用化学试剂、光谱、核磁共振等技术对其进行区分，但由于不同产地白术的亲缘关系较近，外观相似，且含有的化学成分较雷同，利用传统的中药鉴定方法较难进行鉴定。利用分子生物学的技术，从基因水平进行的中药分子鉴定方法，由于不受外界因素和生物体发育阶段及组织器官差异的影响，具有准确性高、重现性好等特点。本发明提供的PCR检测法就是一种浙白术的DNA分子鉴定方法，能够准确鉴定浙白术。目前利用PCR检测法对浙白术进行鉴定尚未见报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种能够准确鉴定中药浙白术的PCR鉴定试剂盒和检测方法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测法的检测步骤。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种浙白术PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为ZBZ1和ZBZ2：

ZBZ1：5’-CAAGTTGGATACACTCCTGG-3’，

ZBZ2：5’-CTACTACCATCGCAAACTCT-3’。

进一步，所述的浙白术PCR鉴定试剂盒的组成为：

本发明还涉及一种利用所述浙白术PCR鉴定试剂盒对浙白术进行鉴定的方法，所述方法为：

(1)模板DNA的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量(检测方法同步骤(3))，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；

(2)PCR鉴定：利用浙白术PCR鉴定试剂盒中的特异性引物ZBZ1和ZBZ2，进行PCR扩增：

PCR反应溶液：

将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性3min，94℃变性45s，60～65℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min；

(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物(即扩增反应后的反应液)5μL与加样缓冲液(即PCR buffer)1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在540bp处出现扩增条带的为浙白术，在540bp处不出现扩增条带的不是浙白术。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明根据凝胶电泳在540bp处有无扩增条带作为鉴定浙白术的依据，可以检测单个或者混合白术DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好；(2)利用浙白术PCR鉴定试剂盒中引物ZBZ1和ZBZ2以及PCR反应溶液配方可以制造浙白术鉴定试剂盒；(3)本发明提供了一种快速、准确鉴定浙白术的方法，可以广泛应用于浙白术中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。

(四)附图说明

图1为十四种供试品经浙白术PCR鉴定试剂盒鉴定后的电泳图，泳道1～14分别为浙白术、河北小白术、湖南平术、安徽徽术、苍术、关苍术、杭白菊、野菊、黄精、蒲公英、向日葵、浙贝母、杭麦冬、益母草，泳道M为marker。

图2为不同浓度的浙白术经浙白术PCR鉴定试剂盒鉴定后的电泳图，泳道M为Marker，泳道1为0.05ng/μL浙白术，泳道2为0.5ng/μL浙白术，泳道3为5ng/μL浙白术。