[发明专利]用于定位竹类植物组织内源激素IAA的改良方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种专门定位竹类植物组织内源激素IAA的方法，具体涉及一种利用改良免疫金银染色技术来定位植物组织内源激素IAA的方法，属于免疫细胞化学领域。

背景技术

免疫金银染色法定位植物组织内源激素IAA，是在石蜡切片的基础上，利用抗原-抗体特异性反应，将带有胶体金颗粒的二抗与已经孵育好一抗的植物组织切片特异性反应，使胶体金颗粒标记在组织中有植物内源激素的地方，最后用含有硝酸银的显色液进行显色。显色原理是硝酸银在还原剂对苯二酚的作用下被还原成银原子，金颗粒能吸附银原子，使银原子在其周围聚集成团，从而放大金颗粒的示踪效果，在光学显微镜下就能观察到植物内源激素的位置。

《紫丁香叶柄离区IAA的免疫组织化学定位》(王幼群，植物学报2001，43(2)：213-216)公开了一种定位植物组织内源激素IAA的方法，其是在冰冻切片的基础上，用免疫胶体金银法，对紫丁香叶片脱落过程中IAA在叶柄离区的分布进行定位。具体采用的技术措施如下：

(1)材料用含4％多聚甲醛和1％戊二醛(用0.2M，PH＝7.2的磷酸缓冲液PBS配制)的固定液在4℃下固定8h；

(2)材料经磷酸缓冲液充分洗涤，然后在2700-Fregocut冰冻切片机上切取20μm厚的冰冻切片；

(3)将冰冻切片移到2ml的称量瓶中，对切片先用1ml、0.1％的胰蛋白酶溶液于37℃处理5min，然后用0.1％的PBST(0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)+0.15mol/L NaCl+0.1％Triton X-100)冲洗三次，每次5min，接下来用PBSTG(1:50正常羊血清/PBST)于37℃封闭15-20min，封闭结束后不清洗；

(4)向切片中加入1:500一抗/PBSTG，4℃孵育过夜；

(5)用PBSTG冲洗切片后加入1:50金标二抗/PBSTG，4℃孵育过夜；

(6)用0.1％的PBST和重蒸水冲洗切片，然后将切片移入干净的小烧杯中，在银显影液(100ml显影液含有对苯二酚1.7g，10％的硝酸银溶液1ml，PH3.5，0.1M的柠檬酸缓冲液99ml)中黑暗条件下显影5min；

(7)用自来水冲洗后将切片置于载玻片上，在光学显微镜下观察、照相。

目前有关竹类植物竹笋内源激素金银法免疫定位尚没有相关报道。该论文运用了冰冻切片，虽然缩短了制片时间，较好的保持了抗原的活性，但对实验仪器的配置与操作要求相对较高。同时，冰冻切片易造成细胞的内膜系统破坏，结构不清晰。且不是每个实验室均有冰冻切片机，另外竹笋尤其节间停止生长的竹笋非常硬，冰冻切片机根本切不动。

另外，由于该论文没有EDAC前固定，在一抗孵育之前的实验过程中，组织细胞中的内源激素容易流失，对实验结果造成不利影响。并且，该实验的一抗孵育和二抗孵育均在4℃，冰箱中过夜，使整个实验周期延长至3天，耗时较长。

此外，该实验显色液没有说明溶剂成分，如果用纯水，则显色反应会非常迅速，使显色时间不容易把握。

最重要的是，试验采用PBS作为缓冲液以及溶剂，然而PBS易与常见的钙离子、镁离子等金属离子缔合形成沉淀，从而干扰显色效果。

《杨树试管苗嫩茎生根过程中内源IAA的免疫金银定位》(董宁光，尹伟伦，等，植物学报2011,46(3)：324-330)公开了另一种定位植物组织内源激素IAA的方法，其在石蜡切片的基础上运用免疫胶体金银法对杨树生根过程中，内源生长素IAA的分布进行了定位。具体采用的技术措施如下：

(1)材料用2％EDAC在室温下抽气固定24小时；

(2)经0.2mol/l二甲砷酸钠缓冲液(PH7.2)冲洗后，转入4％多聚甲醛+1％戊二醛中，室温下抽气固定24小时，4℃保存7-8小时；

(3)用0.2mol/l二甲砷酸钠缓冲液(PH7.2)将固定好的材料冲洗18-24小时；

(4)系列酒精脱水、石蜡包埋、切片；

(5)0.1％的胰蛋白酶溶液于37℃处理5分钟；

(6)用3mol/L尿素消化20分钟含2.5％BSA的TBST(0.05mol/lTris-HCI+0.15mol/lNaCI+0.3％Triton X-100，PH7.6)洗涤3次，每次5分钟；

(7)用TBSTG(TBST+10％正常羊血清+2.5％BSA)37℃封闭1小时；

(8)加入经TBSTG稀释400倍的一抗，37℃静置温育24小时；