[发明专利]A型流感病毒基因PCR扩增引物及其快速克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种流感病毒基因克隆方法，具体涉及A型流感病毒基因PCR扩增引物及A型流感病毒基因快速克隆方法。

背景技术

流感病毒反向遗传技术的建立，对了解流感病毒多样性，明确基因型与表型关系，流感病毒疫苗研制及流感病毒的有效防控做出了重要贡献。但是，在传统的流感病毒反向遗传技术中，流感病毒基因的克隆依赖于限制性内切酶的酶切以及连接酶的连接。实践表明，用传统方法克隆一株流感病毒的8个基因片段到流感病毒反向遗传拯救载体是个相当耗时、耗力的过程，特别是在克隆未知序列的流感病毒基因中存在引物中限制性内切酶位点时。虽然国外学者报道了流感病毒基因不依赖于限制性内切酶的克隆策略。但是，目前已报道的这些方法，对于完整克隆一株流感病毒8个基因片段用于病毒拯救还是个相当复杂的过程，效率不高。因此，简化传统流感病毒反向遗传技术中流感病毒基因的克隆过程、提高克隆效率，对推进流感病毒分子生物学特性研究以及制定及时有效的防控策略具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供A型流感病毒基因PCR扩增引物及A型流感病毒基因快速克隆方法，从而大大简化传统的流感病毒反向遗传技术中的基因克隆过程，解决传统的流感病毒反向遗传技术中流感病毒基因的克隆过程复杂、效率不高的问题。

为解决以上技术问题，本发明提供了A型流感病毒基因PCR扩增引物，其包括以下序列的引物：

流感病毒的8个基因片段的引物：

a,流感病毒基因片段PB2的引物：

上游引物：5‘GGGAGCGAAAGCAGGTC’3；

下游引物：5‘TTAGTAGAAACAAGGTCGTTT’3；

b,流感病毒基因片段PB1的引物：

上游引物：5‘ GGGAGCGAAAGCAGGCA’3；

下游引物：5‘TTAGTAGAAACAAGGCATTT’3；

c,流感病毒基因片段PA的引物：

上游引物：5‘GGGAGCGAAAGCAGGTAC’3；

下游引物：5‘TTAGTAGAAACAAGGTACTT’3；

d,流感病毒基因片段HA的引物：

上游引物：5‘GGGAGCAAAAGCAGGGG’3；

下游引物：5‘TTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT’3；

e,流感病毒基因片段NP的引物：

上游引物：5‘GGGAGCAAAAGCAGGGTA’3；

下游引物：5‘TTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT’3；

f,流感病毒基因片段NA的引物：

上游引物：5‘GGGAGCAAAAGCAGGAGT’3；

下游引物：5‘TTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT’3；

g,流感病毒基因片段MP的引物：

上游引物：5‘GGGAGCAAAAGCAGGTAG’3；

下游引物：5‘TTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT’3；

h,流感病毒基因片段NS的引物：

上游引物：5‘GGGAGCAAAAGCAGGGTG’3；

下游引物：5‘TTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT’3；

流感病毒反向遗传线性化载体的引物：

上游引物：5‘CCTTGTTTCTACTAATAACCCGGCGG’3；

下游引物：5‘CCTGCTTTCGCTCCCCCCCAACTTCGG’3。

其中，PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，MP和NS是本领域的通用名，是流感病毒的8个基因片段的名称，分别为Polymerase basic protein 2、PB1 Polymerase basic protein 1、Polymerase acidic protein、Hemagglutinin、Nucleoprotein、Neuraminidase、Matrix protein和Nonstructural protein的缩写。

本发明还提供了一种A型流感病毒基因快速克隆方法：用上述引物通过PCR反应即聚合酶链式反应扩增出流感病毒基因片段PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，MP和NS，以及线性化的流感病毒反向遗传载体，然后利用重组酶将上述线流感病毒各基因片段以及线性化的流感病毒反向遗传载体在体外重组克隆，并转化到大肠杆菌进行克隆。

进一步的，所述的重组酶为ExnaseTM II。

本发明的有益效果是：