[发明专利]重组红鳍东方鲀干扰素调节因子2蛋白及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业化生产的红鳍东方鲀干扰素调节因子2蛋白的制备方法。

背景技术

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是一种重要的近海经济鱼类，由于其肉质细腻、味道鲜美深受人们的喜爱。在红鳍东方鲀的生殖腺和肝脏等内脏中产生的河豚毒素，其高活性和高特异性的生物特征具有潜在的医药开发价值，在临床上具有广阔的前景。然而，水环境中存在的大量细菌和病毒使鱼类的皮肤和黏膜不断受到侵袭，这些病原微生物侵入鱼体后会使鱼体发生病变甚至死亡，给红鳍东方鲀的大规模养殖造成严重损失。细胞因子是脊椎动物机体免疫系统调节免疫应答的一部分，在免疫系统的相关研究中占据重要地位。干扰素调节因子（IRFs）是一类结构上保守的转录因子家族，所有IRF在N端均包含一个由115个氨基酸残基构成的具有螺旋-转角-螺旋的DNA结合域（DNA binding domain, DBD），IRF通过DBD结合到特定的DNA基序上。IRF在干扰素的转录调控、免疫细胞（如树突状细胞、NK细胞和T细胞）的发育、细胞因子的信号转导及抗肿瘤方面起到非常重要的作用。然而，从红鳍东方鲀中直接提取该蛋白的操作复杂、成本高、产量少，不能大规模产业化生产。

发明内容

本发明提供一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于产业化生产的红鳍东方鲀干扰素调节因子2蛋白的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种重组红鳍东方鲀干扰素调节因子2蛋白，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示，氨基酸序列号如SEQ ID NO：2 所示。

 一种上述重组红鳍东方鲀干扰素调节因子2蛋白的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 提取红鳍东方鲀肾脏总RNA，并反转录进行第一链的cDNA的合成；

b. 以所得到的第一链的cDNA为模板、以具有NcoⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的RT-PCR反应引物进行RT-PCR反应；所述RT-PCR反应引物序列如下：

上游引物：5’CATGCCATGGGCATGCCCGCAGAAAGAATGA 3’；

下游引物：5’CCGCTCGAGGGAGGAAGTGACATCAGAGGTC 3’；

c．电泳回收RT-PCR产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆，选择957bp大小的条带进行回收；

d．用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ分别双酶切c步骤所回收的产物和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α进行培养并提取重组表达质粒；

e．将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）内，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的5ml LB液体培养基过夜培养得到菌种；

f. 将所收集的菌种进行扩大培养，经IPTG诱导后收集菌体；

g. 将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。

所述RT-PCR反应条件为：94℃预变性5分钟后进行94℃变性30秒、57℃复性30秒、72℃延伸30秒的30个循环的扩增，72℃延伸7分钟后保存于4℃。

所述f步骤是将所收集的菌种按1：100的比例接种于Amp LB液体培养基，37℃ 200转/分摇菌2.5小时，至OD₆₀₀为0.4，所摇菌液加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，37℃摇菌6小时，收集菌体；

所述g步骤是用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并将细菌裂解液12000转，4℃离心20分钟，将上清上样于层析柱，用平衡液洗涤后加入300mM的咪唑洗脱收集洗脱液。