[发明专利]猪H11位点的DNA片段及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及能被定点插入的猪H11位点的DNA片段及其应用。

背景技术

基因修饰主要是指利用生物化学方法修改DNA序列，将目的基因片段导入宿主细胞内，或者将特定基因片段从基因组中删除，从而达到改变宿主细胞基因型或者使得原有基因型得到加强的作用。基因修饰目前已经广泛应用于人类生活的各个领域，例如，在医学上，可以利用基因修饰的方法抑制某些病毒类宿主细胞内的病毒复制，从而达到治疗的目的；在农业上，利用基因修饰的方法，人们已经成功地改变了农作物和畜禽的生产特性，从而达到改良以及传播优良品种的目的。

在基因修饰的过程中，通常需要进行目标基因的表达，那么就需要有一个载体去容纳你要的目标基因。而DNA编码密码子是3个一个。外源目标基因不能随便插入，否则不能正确表达，还会把原有的顺序弄乱，造成基因重排。插入位点就是可以插入基因的位点，在它那里插入外源基因，不会改变原有质粒的复制及表达，还能使自身有正常表达的机会。目前，使用较多的插入位点是Ros26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，因此需寻求一种更适宜的插入位点。

2010年，斯坦福大学的Simon Hippenmeyer及其研究团队在小鼠的第11号染色体上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hipp11位点，简称H11位点。H11位点位于Eif4enif1与Drg1两个基因的间隙，与Eif4enif1基因的19号外显子和Drg1基因的9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hipp11位点定点基因修饰的小鼠与野生型小鼠生长发育无区别。此外，H11位点由于其位于两基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hipp11这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术不足提供一个供基因插入的猪H11位点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述的猪H11位点的核苷酸序列，如序列表中的序列1所示。

进一步的，上述的猪H11位点的核苷酸序列，如序列表中的序列2所示。

可进一步的，上述的猪H11位点的核苷酸序列，如序列表中的序列3所示。

本发明的另一个目的是将上述基因位点用于构建猪定点突变库上。

本发明的再一个目的是提供一种含有上述猪H11位点序列的试剂盒。

本发明提供的猪H11基因位点由于位于两个基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的完成目的基因的定点插入。此外，在该位点插入基因安全性高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。在猪的基因组中定位H11这样安全有效的基因修饰位点，通过在细胞或个体水平上对猪H11基因进行敲除或修饰，以构建猪H11基因突变库,为培育优良品系的猪提供前期技术支持。

附图说明

图1为测序检测分析酶切载体结果图；

图2为利用CRISPR/cas9靶向切割系统构建的绿色荧光蛋白定点插入猪H11位点后细胞PCR扩增鉴定结果图；以及

图3A和图3B为阳性克隆的荧光激发图；其中图3A为可见光下的细胞显微观察图，图3B为紫外光下的细胞显微观察图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

如背景技术中所提到的，在培育猪的优良品种时，主要采用随机整合的方式使外源基因随机插入猪基因组中，为后续分析带来了麻烦，为了克服上述缺陷，本发明提供了一种能定点插入的位点序列，利用该位点可构建该位点的切割系统以及定点插入的打靶载体系统，该方法操作简单，同时能让外源基因稳定在H11表达，为转基因搭建了稳定的平台。

下面将结合具体的实施例来说明本发明的有益效果。