[发明专利]检测增强型绿色荧光蛋白基因的引物及其筛选方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于检测增强型绿色荧光蛋白基因的引物及其筛选方法与应用。

背景技术

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，在紫外光或蓝光的激发下可发出绿色荧光，由于该蛋白可活体检测且具有对细胞无毒害等优点，被广泛应用于生命科学多个领域，尤其在分子生物学和细胞生物学中GFP基因是一个非常常用的报告基因。

目前应用较多的GFP是增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescent protein,EGFP)，其为GFP的突变体(64位苯丙氨酸突变为亮氨酸)，所发射的荧光强度比GFP大6倍以上。因此，EGFP较GFP而言更适合作为一种报告基因来研究基因的表达、细胞的分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。

随着转基因技术的快速发展，全球转基因产品日益增多，转基因检测成为一个必不可少且至关重要的工作。转基因检测对象主要基于外源基因(启动子、标记基因、报告基因和目的基因等)的核苷酸序列和蛋白表达产物，检测方法中应用最广泛的是基于外源基因核苷酸序列所建立的常规定性PCR(Polymerase Chain Reaction)检测。

常规PCR方法作为分子生物学实验中的基础实验方法，具有操作简易、成本费用低等优点。但作为转基因检测方法，常规PCR检测存在灵敏度低、容易产生交叉污染、假阳性和假阴性比例偏高的缺点。以上问题的存在，很大程度上可能是由于检测引物不够特异。本发明为解决转基因常规PCR检测中的常见问题，针对转基因作物依据EGFP基因序列开发设计专化性引物156对，并通过3轮有目的针对性的筛选，选出2对在实验操作中可以准确检测EGFP基因的引物。

发明内容

本发明旨在于克服现有技术的不足，提供了用于检测增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的引物，其筛选方法与应用为转基因外源基因检测引物的开发和筛选提供一定的科学依据。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种检测增强型绿色荧光蛋白基因的引物，其特征在于，所述引物为EGFP1或EGFP2；所述EGFP1的正向引物碱基序列如SEQ ID NO:1所示，EGFP1的反向引物碱基序列如SEQ ID NO:2所示；所述EGFP2的正向引物碱基序列如SEQ ID NO:3所示，EGFP2的反向引物碱基序列如SEQ ID NO:4所示。

一种检测增强型绿色荧光蛋白基因的引物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：采用Primer3软件设计检测EGFP基因的强专化性引物，在基因上游设计12个引物，命名为gfpF_n(n＝1，…,12)；在基因下游设计13个引物，命名为gfpR_m(m＝1，…，13)；上下游引物分别两两组合，共组合156(12×13)对引物；

步骤B：利用Karroten质粒提取试剂盒提取EGFP的表达质粒，利用植物基因组DNA提取试剂盒分别提取转基因作物叶片DNA和非转基因作物叶片DNA；

步骤C：引物筛选的方式分为3轮，每轮筛选设置重复实验一次，第1轮筛选：利用无菌水作为模板进行PCR扩增，除去以无菌水为模板仍可扩增出条带的引物，筛选出64对引物；第2轮筛选：利用第1轮筛选出的引物，以EGFP的表达质粒DNA和无菌水为模板进行PCR扩增，选出能扩增出EGFP基因条带并且在无菌水中扩增不出条带的引物，筛选出16对引物；第3轮筛选：利用第2轮筛选出的引物，以质粒DNA、转基因和非转基因作物DNA、无菌水4种为模板进行PCR扩增，选出能在质粒及转基因作物中扩增出EGFP基因条带、在非转基因作物及无菌水中扩增不出条带的引物，筛选出2对引物(EGFP1和EGFP2)。

作为优选地，所述转基因作物为转基因玉米，非转基因作物为非转基因玉米。

作为优选地，在所述步骤A中，检测EGFP的强专化性引物的设计条件：Tm值(melting temperature)为50℃～60℃，以58℃最佳；GC含量为50％～70％，以55％最佳；引物长度为17bp～24bp，以20bp最佳。