[发明专利]检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，是一种DNA水平的基于定量荧光PCR(Quantitive Fluoresent PCR，QF-PCR)的检测方法，可以对常见的21、18、13三体综合征以及X、Y性别染色体数目异常进行快速、简便、准确的检测。

背景技术

染色体数目异常和结构畸变是导致出生缺陷的重要原因之一(Gardner R J M,Sutherland G R.Chromosome abnormalities and genetic counseling[M].New York:Oxford University Press,1996:300-320.)，染色体非整倍体疾病属于染色体数目异常，包括单体型、三体型、多体型和嵌合体。临床上常见包括21三体综合征(Down’s syndrome)、18三体综合征(Edward syndrome)、13三体综合征(Patau syndrome)、以及一些性染色体畸变，如Klinefelter综合征(47,XXY)和Turner综合征(45,X)等。研究表明13、18、21及X/Y染色体异常占新生儿染色体数目异常的95％，这给家庭的社会造成沉重负担。由于至今还没有有效预防和治疗方法，因此，在产前及时诊断21号染色体异常并终止妊娠对降低出生缺陷、提高人口素质有重要意义。

目前，临床上以染色体核型分析为诊断金标准，然而该技术有很大局限性。首先要进行羊膜穿刺取羊水，然后培养羊水中胎儿细胞，再进行核型分析。整个周期需要2-3周，操作复杂，需要有经验的检测人员操作。另外近几年应用的技术为荧光原位杂交(FISH)，这一方法较核型分析速度稍快，不需细胞培养，利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶DNA进行杂交。再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。这两种方法都具有成本较高，周期长，对操作人员要求较高的特点，同时结果为图片，需要人工判读或干预，难以实现自动化和高通量分析。

QF-PCR技术是，通过荧光引物对样本DNA的不同区域进行PCR扩增(因此荧光信号变量与扩增产物变量成正比)，随后采用高分辨率胶电泳(如用于测序的毛细管电泳)对扩增片断进行分离，通过荧光检测系统确定扩增片断的长度并实现对多态位点的分型，通过扫描软件对预期大小的扩增产物对应的峰面积定量，实现对原始模板量的定量。定量荧光PCR体系(Quantitative Fluorescent PCR，QF-PCR)中同时扩增多个21、18、13、X和Y染色体上的短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STR)基因座，利用STR基因座的多态性来判断染色体数目。非整倍体数目异常是由染色体数目增多或减少一条引起的疾病，因此对染色体上的STR位点经过QF-PCR扩增、检测会得到1:1:1的三个峰、2:1的两个峰或一个峰，其中前两种情况是三体综合征样本相对于正常样本所特有的。STR位点多态性越高则出现单一峰的几率越小，出现前两种情况比例越大。对多个特定染色体上的STR位点进行检测，综合考量各个位点峰数量和峰面积即可判定检测样本是否为三体综合征。

1993年Mansfield首次报道应用STR(Short Tandem Repeats，短串联重复序列)进行QF-PCR，成功检测21三体综合征(Mansfield，Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative PCR and small tandem repeat polymorphisms.Hum Mol Genet.1993；2:43–50.)。此后越来越多的研究者采用STR基因座联合检测的方法来诊断。如：专利200510025466.8，分子生物学法三体检测试剂盒，通过七个QF-PCR体系检测3个21号染色体、2个18号染色体和2个13号染色体STR位点；专利200410021619.7，一种生物非整倍体的检测方法，每条染色体选用6-9个STR位点，一个体系包含3-4个同一染色体STR位点；专利201310555078.5，一种单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，通过1个QF-PCR体系检测23个位点，包括6个21号染色体的STR位点，5个18号染色体的STR位点，4个13号染色体的STR位点和8个性染色体位点。上述专利往往采用的STR位点不合理或数目较少，且每个QF-PCR扩增体系中包含的位点数量少，导致检测效率和准确性不够高。

发明内容