[发明专利]一种土壤中分离棉铃疫病菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业领域，具体涉及一种土壤中分离棉铃疫病菌的方法。

背景技术

烂铃是棉花生产上的一大重要病害，近年来，棉花烂铃病在黄河流域发生非常严重,棉花品质降低，产量下降，棉农经济损失严重。棉铃疫病是棉花铃病的主要病害之一，开展棉铃疫病研究能有效加强对棉花烂铃的控制。目前开展棉铃疫病研究时病菌采集主要有两种途径，一种是从发病棉铃上分离获得，此种方法因为已经有发病组织，所以较易获得疫病致病菌，而且此种方法需要获得发病棉铃，全年只能在棉花结铃初期进行采集；另一种方法是从土壤中分离获得，此种方法不受采集时间限制，全年都可在棉田内采集土壤，然后进行致病菌分离。

土壤中病原真菌的分离。为了分离土壤中特定的病原真菌，需要用特殊的方法和选择性培养基。疫霉属真菌的分离从土壤中分离疫霉属的真菌，可采用以下两种方法：

1、利用植物的组织或器官作为饵料。棉铃疫病菌的分离，可将棉铃，放在保湿箱中，每个棉铃用50g的土样，覆盖，在20～22⁰C下培养5～6d观察孢子囊的产生。此种方法棉铃可以在棉花铃期从种植棉田采集获得，但在其他时间12月-7月，需要在温室中盆栽棉花，获得棉铃。

2、棉铃疫病菌的土壤分离，也可以用选择性培养基直接从土壤中分离。此种方法成本较高，需要使用特殊的选择性培养基，成本和操作过程复杂。

发明内容

本发明针对不足，提出土壤中分离棉铃疫病菌的方法，其特征在于：使用苹果作为诱饵，分离土壤中的棉铃疫病菌。

为实现上述发明的目的，本发明提供以下技术方案：一种土壤中分离棉铃疫病菌的方法

1、市场购买的苹果，用清水洗净后擦干，用75%酒精进行表面消毒后待用。

2、将棉田采集的土壤放入大小适中的容器内（方盒或小盆），用喷雾器喷施纯净水进行土壤湿润，湿度达到土壤手握成团，轻捏即散的状态即可，不要过于潮湿。

3、表面消毒后的苹果，在上半部和下半部分分别按照十字对称的方位进行接菌针打孔，每个打孔点打孔一个，直径在1mm以内，整个苹果共打孔8个。

4、将苹果埋入容器中的土壤内，25⁰C条件下培养，每日观察苹果的发病情况，待苹果发病后将病健交界处苹果组织接入到燕麦培养基平板上进行进一步培养，可获得棉铃疫病致病菌。

与现有技术相比，本发明施药方法将苹果用于替代棉铃，进行棉铃疫病的致病菌分离具有以下优点：

1、使用苹果作为棉铃的替代组织，苹果更易获得，全年均可购买，不受时间限制。

2、苹果适合棉铃疫病的致病菌的生长，对棉铃疫病的致病菌获率高。

3、苹果果皮较厚，对苹果保护作用好，土壤中诱捕发病时未打孔部位不易被病菌侵染，发病部位集中在打孔的周围，便于后期操作。

4、苹果体积较大，可设的打孔点8个，增加了棉铃疫病的致病菌的侵染点，筛选效率提高。

5、简化了棉铃疫病的致病菌分离步骤，缩短了分离时间，提高了致病菌分离成功率和分离效率。

具体实施方式

实施例

（1）带菌土壤采集：常规棉田，5点取样，取表层3cm下土壤，每个取样点取土500g，混合均匀待用，入土壤过于干燥需盆纯净水进行润湿，湿度达到土壤手握成团，轻捏即散的状态即可，不要过于潮湿。

（2）苹果表面消毒：购买大小适中的苹果，用清水洗净后，用纱布或吸水纸擦干表面水分，用蘸有75%酒精的棉球，均匀擦拭苹果表面，然后在苹果上半部和下半部分分别按照十字对称的方位进行接菌针打孔，每个打孔点打孔一个，直径在1mm以内，整个苹果共打孔8个。

（3）将2-3个打好空的苹果埋入土壤中，每天观察打孔处苹果发病情况。

（4）待多个打孔点发病后，将苹果取出，用清水冲洗后待用。

（5）分离用的培养基采用燕麦培养基：燕麦片30克、琼胶17克、水1000毫升。燕麦片加水1000毫升,在沸水浴上加热1小时,纱布过滤后加水补足1000毫升,加琼胶熔化后分装灭菌(121摄氏度,20分钟)，自然冷却至50摄氏度时倒入培养皿中，培养基凝固后备用。

（6）致病菌分离：将洗净擦干的苹果在超净工作台内再次进行表面消毒，使用75%酒精棉球擦拭表秒，用灭菌后的小手术刀片将苹果病健交界部位的表皮划开小口，挑出发病的苹果组织，放入预先制备好的培养基平板中，培养皿用封口膜封闭后倒置于30⁰C培养箱内培养。