[发明专利]能够促进丹参毛状根中丹酚酸积累的诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导方法。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza)为唇形科植物丹参的根及根茎，有活血祛瘀，清热安神、养血益气之功效。丹酚酸是丹参有效成分之一，主要包括迷迭香酸和丹酚酸B等。由于在治疗心血管系统疾病中的突出表现和无毒负作用的特点，丹参的应用和研究也越来越广泛。

目前现有的丹参毛状根可采用6,7-V培养基进行培养。一般称取新鲜毛状根0.15～0.2g接种于50mL的6,7-V培养基中进黑暗培养。丹参毛状根在生产丹参有效成分方面有着巨大潜力，但活性成分含量较低已成为制约丹参毛状根应用的瓶颈。

含30g/L蔗糖的6,7-V培养基的配方如表1所示，pH值为5.8，121℃灭菌20min。

表1、6,7-V培养基的配方

硝普钠为鲜红色透明粉末状结晶，易溶于水。由于其作用迅速，而且消失也快，是治疗高血压急症及急性左心衰竭的常用药物。

王娟等采用NO供体硝普钠处理药用观赏植物鸡冠花幼苗，较对照显著提高了干旱胁迫下鸡冠花幼苗叶片的光和色素、可溶性糖及可溶性蛋白的含量，以及超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧氢酶的活性，提高了鸡冠花幼苗的抗旱能力。郭春梅等，建立青钱柳细胞悬浮培养体系，以硝普钠为外源诱导物对其三萜的合成进行诱导，在接种后的第8d添加150μmol/L硝普钠，持续作用4d后收获效果最佳，总三萜酸产量可达1228.74mg/L，为对照组的2.14倍，其中熊果酸(UA)和齐墩果酸(OA)分别比对照组提高了2.28倍和2.48倍。研究结果表明，外源添加硝普钠能有效地促进青钱柳悬浮细胞三萜酸的合成。

但是，目前现有技术没有告知硝普钠能够促进丹参毛状根中丹酚酸的积累。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能够促进丹参毛状根中丹酚酸(主要包括迷迭香酸和丹酚酸B)积累的诱导方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种能够促进丹参毛状根中丹酚酸积累的诱导方法，包括以下步骤：

1)、丹参毛状根的初培养：

在每50mL的6,7-V培养基中接种0.15～0.2g丹参毛状根，于100～150rpm、24～26℃的培养条件下黑暗培养17～19天；

2)、丹参毛状根的继续培养：

然后添加硝普钠，使6,7-V液体培养基中硝普钠的终浓度为90～110μM；于100～150rpm、24～26℃的培养条件下黑暗培养5～7天；从而实现促进丹参毛状根中丹酚酸的积累。

作为本发明的能够促进丹参毛状根中丹酚酸积累的诱导方法的改进：

步骤2)中硝普钠的终浓度为100μM。

作为本发明的能够促进丹参毛状根中丹酚酸积累的诱导方法的进一步改进：

所述步骤1)和步骤2)的培养条件均为：110rpm，25℃；

步骤1)的黑暗培养时间为18天，步骤2)的黑暗培养时间为6天。

备注说明：丹参毛状根的初培养和继续培养均在超净台中进行(此为常规技术)。

收集经本发明方法诱导处理后的丹参毛状根，用蒸馏水冲洗，再用干净的纸吸干水份，最后在50～60℃烘箱中干燥至恒重后进行迷迭香酸和丹酚酸B的含量检测(为常规技术)。例如可采取以下步骤：

干燥毛状根研钵中磨碎，过0.45mm筛，精密称取0.05g，放入5mL离心管中，加入2.5mL甲醇-水提取液(由甲醇：水＝7:3的体积比混合而得)，于40K HZ超声参数下超声提取45min，提取液12000rpm离心15min，取上清液过0.45μm滤膜，备用。

色谱条件为：含量测定采用Waters 1525二元高效液相色谱仪，色谱柱为Waters SunFire C18(250mm×4.6mm，5μm)。流速1mL min-1，柱温30℃，上样体积20μL；检测波长288nm，流动相乙腈和0.01％磷酸水溶液，梯度洗脱，测定迷迭香酸和丹酚酸B含量。

备注说明：

丹参毛状根采用发根农杆菌(ATCC15834)侵染丹参试管无菌苗获得，此为常规技术。

以步骤2)中设置不使用硝普钠为对照，结果表明本发明与对照相比，迷迭香酸和丹酚酸B含量分别提高到3.181mg/g和11.17mg/g；达到对照水平的4倍和5倍以上，其中丹酚酸B含量高于《药典标准》的3倍以上。

附图说明