[发明专利]利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法

权利要求书

1.一种利用斑马鱼胚胎测试天然植物提取物急性毒性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

配制胚胎培养液，即胚胎的培养用水，其中胚胎培养液含有：NaCl 5mM，KCl0.17mM，C aCl₂0.33mM，MgSO₄0.33mM，以1M NaOH调节pH至6.8-7.0，电导率在500-550μs；

将植物提取物粉末以二甲基亚砜溶解至澄清，过滤2次，用胚胎培养液稀释，获得含植物提取物不同浓度的稀释液，不同浓度的稀释液中所含二甲基亚砜最终浓度一致且最终浓度小于等于1.2％(V/V)；用不同浓度的稀释液培养斑马鱼胚胎，然后在7-72hpf观察记录不同浓度的稀释液对斑马鱼胚胎发育的影响，来判断植物提取物对斑马鱼胚胎发育的毒性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的斑马鱼胚胎为处于4hpf的胚胎。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述斑马鱼胚胎通过如下方法选择：选择游动和体色均正常3月龄的斑马鱼，繁养条件：通过光控系统，保持光照14h/黑暗10h交替的光照周期；水温维持在28.5℃；繁养用水电导率控制在500-550μs，由NaCl饱和溶液调节；同时pH控制在7.2-7.5，由NaHCO₃溶液调节；投喂由美国大盐湖丰年虫卵，孵化24h的丰年虾，2-3次/天；选择游动和体色均正常，摄食无异常的4月以上性成熟的健康成鱼(更优选为5月龄)进行配对，产卵前天傍晚亲鱼经投喂后，按照雌雄比例1:2或1：1，放入交配盒，以透明挡板分开，第二天早上经光刺激后于9点-10点取出挡板，自然交配并收集受精卵，用胚胎培养液清洗1-2次去除坏卵、粪便和杂质后，置于胚胎培养液中，在28.5℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，每毫升培养液中最多只培养10个胚胎；当4hpf时，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述培养斑马鱼胚胎的方法如下：将斑马鱼胚胎以胚胎培养液清洗两遍，随机移取胚胎至加有1ml胚胎培养液/孔的24孔板中，每孔10胚胎，用巴氏吸管吸去胚胎培养液后迅速加入不同浓度的稀释液，每浓度3个复孔，同时设置对照组胚胎培养液组和二甲基亚砜组，二甲基亚砜组是将二甲基亚砜用胚胎培养液稀释，其中二甲基亚砜组的浓度与待检测的各稀释液中的浓度一致，每孔加液1ml，每24h换液一次。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述不同浓度的稀释液中所含二甲基亚砜最终浓度一致且最终浓度为0.3％或0.5％(V/V)。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：观察记录的时间为：7hpf、24hpf、31hpf、48hpf、55hpf、72hpf。