[发明专利]一种白细胞介素21和4-1BBL诱导外周血单个核细胞中NK细胞增殖的方法

说明书

本发明公开了一种白细胞介素21和4‑1BBL诱导外周血单个核细胞中NK细胞增殖的方法。该方法包括如下步骤：将初始NK细胞与固相化的细胞因子共培养，使NK细胞增殖。实验结果表明：利用固定化的细胞因子直接刺激未经筛选的人外周血中的淋巴细胞群，大量扩增了具有杀伤活性的原代NK细胞，并将刺激NK细胞的信号传导转化为人为可控的形式，在临床上为NK细胞治疗提供了安全有效、便利且效果稳定的扩增方案，并为随后的改造NK细胞和研究信号传导机制提供基础研究。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种白细胞介素21和4-1BBL诱导外周血单个核细胞中NK细胞增殖的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cells,NK细胞)是淋巴细胞的一个亚群，占外周血淋巴细胞总数的10％～15％。常用的人NK细胞的表型标志是CD56⁺、CD16⁺、CD19^‐、CD3^‐，与T细胞的表型(TCRαβ或TCRδγ或CD3⁺)和B细胞的表型(CD19⁺或BCR)有显著差异。NK是不同于T、B细胞，具有直接杀伤靶细胞效应的一类淋巴细胞，其对靶细胞的杀伤作用表现为一种速发效应，无须预先致敏，与靶细胞混合后4小时内即发挥杀伤效应。NK细胞杀伤效应的机制与细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)相似，靶细胞包括肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞及机体某些正常的细胞。NK细胞具有抗肿瘤、抗感染、免疫调节等功能，并参与移植排斥反应，自身免疫病和超敏反应发生。

当前有多种增强NK细胞杀伤肿瘤细胞效益的策略，已知部分的细胞因子比如白介素2，白介素12，白介素15，白介素18，白介素21和I型干扰素(IFN-αand IFN-β)均通过直接或间接激活的作用活化扩增NK细胞。4-1BB/4-1BBL(CD137/CD137L)是一种协同刺激分子。在广义上，协同刺激分子通道是一种依赖细胞膜表面糖蛋白交互作用的细胞间信号传递方式。在结构上4-1BB/4-1BBL属于肿瘤坏死因子(TNFR/TNF)家族，TNFR/TNF家族有超过27个成员，大多数以三聚体的膜分子或可溶性分子形式发挥作用。含有受体相关因子(TRAF)结合域的4-1BBL分子的胞质尾区以受体配体的方式结合到4-1BB上(TRAFs)，随后激活下游信号。有文献报道，伴随NK细胞FcRγIII(CD16)识别靶细胞后，4-1BB/4-1BBL作为协同刺激分子在功能上诱导细胞的活化增殖、抗凋亡作用，尤其是促使NK细胞释放IFN-γ等细胞因子并诱导ADCC作用。此外，目前已知4-1BBL激发的肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞，能产生长久的抗肿瘤效应，也由此被广泛应用到CAR-T细胞治疗中。

免疫磁珠(Immunomagnetic beads,IMB)由载体微球和免疫配基结合而成。载体微球可由不同的制备材料和方法形成疏水-亲水、非极性-极性和带正电荷-带负电荷等不同物理性质。球体内核或夹层添加磁性氧化铁后成为磁性微球，磁珠外层通常包裹以无生物毒性的高分子材料，化学功能由外壳的配基来实现，相关基团常见的有羧基、氨基、环氧基等。再结合免疫活性的功能基团(如抗体、抗原及亲和素类的扩链剂等)，利用特异性的免疫学反应结合目的物(如蛋白、细胞、RNA及多种小分子)，在磁力作用下，发生力学移动，从混合溶液中将特异性结合的物质分离开。具有分离速度快、效率高，可重复性好，操作简单，无需昂贵仪器设备的特点。

上个世纪70年代中期免疫磁珠被发现以来，人们利用其固相化的优点以及免疫学反应的特异性，不断广泛地应用于各个领域中，尤其在免疫细胞分离、细胞培养、免疫吸附、检测细菌和其他微生物方面的应用，甚至创造了相当的产业价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种增殖NK细胞的方法。

本发明提供的增殖NK细胞的方法包括如下步骤：将初始NK细胞与固相化的细胞因子共培养，使NK细胞增殖。