[发明专利]使用稳定辅酶的脱氢酶稳定作用

说明书

本申请是国际申请日为2009年2月19日的国际申请PCT/EP2009/001206进入中国、申请号为200980105640.6的题为“使用稳定辅酶的脱氢酶稳定作用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及通过在稳定辅酶的存在下贮藏酶使酶稳定的方法。本发明进一步涉及用稳定辅酶稳定的酶，及其在用于检测分析物的测试元件中的用途。

背景技术

生物化学测量系统是临床相关的分析方法的重要组成成分。本文优先考虑的事是测量分析物例如代谢物或底物，其借助于酶直接或间接进行测定。分析物在这种情况下借助于酶-辅酶复合物进行转变，并且随后进行定量。这需要待测定的分析物与合适的酶和辅酶接触，其中酶通常以催化量使用。辅酶通过酶促反应得到改变，例如被氧化或还原。这个过程可以直接，或通过介质电化学或光度测定地进行检测。校准提供量度和待测定的分析物浓度之间的正相关关系。

辅酶是与酶共价或非共价结合，并且通过分析物的转变而改变的有机分子。辅酶的突出例子分别是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，由其通过还原分别产生NADH和NADPH。

现有技术中已知的测量系统因对于有限时间段稳定，以及为了达到这种稳定性对环境的特定需求例如冷却贮藏或干燥贮藏而著称。对于具体应用，例如由最终用户自身执行的测试，例如在血糖的自我监控中，通过不正确、不引人注意的错误贮藏发生不正确的结果因此是可能的。通过主要包装打开太长时间的干燥剂耗尽特别可能导致错误测量，这对于一些系统几乎不会被用户鉴别出。

用于增加生物化学测量系统的稳定性的一种已知措施是使用稳定的酶，例如使用来自嗜热生物的酶。进一步的可能性是通过化学修饰例如交联或通过诱变使酶稳定。此外，还可以添加酶稳定剂例如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白，或可以在聚合物网络中例如通过光聚合而封入酶。

还已进行通过使用稳定的介质来改善生物化学测量系统的稳定性的尝试。因此，通过使用具有尽可能低的氧化还原电位的介质，测试的特异性增加，并且在反应过程中的干扰被消除。然而，酶/辅酶复合物的氧化还原电位形成对于介质的氧化还原电位的下限。低于这些电位，与介质的反应减慢或甚至停止。

可替代可能性也是使用不含介质的生物化学测量系统，其中例如存在辅酶例如辅酶NADH的直接检测。然而，此种测量系统的一个缺点是辅酶例如NAD和NADP是不稳定的。

NAD和NADP是对碱不稳定的分子，其降解途径在文献中得到描述(N.J.Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzymes，Academic Press New York，London 1982，编辑J.Everese，B.Anderson，K.You，第3章，第56-65页)。NAD和NADP的降解通过切割核糖和吡啶单位之间的糖基键分别基本上导致ADP-核糖。另一方面还原型NADH和NADPH是对酸不稳定的：例如，表异构化是一种已知的降解途径。在两种情况下，NAD/NADP和NADH/NADPH的不稳定性都来源于核糖单位和吡啶单位之间的糖基键的不稳定性。然而，即使在不急剧的条件下，例如在水溶液中，辅酶NAD和NADP分别仅通过环境水分而水解。这种不稳定性可能导致分析物测量中的不精确。

许多NAD/NADP衍生物例如在B.M.Anderson in The Pyridine Nucleotide Coenzymes，Academic Press New York，London 1982，编辑J.Everese，B.Anderson，K.You，第4章中得到描述。然而，这些衍生物中的大多数不由酶良好接受。迄今为止因此已用于诊断测试的唯一衍生物是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(乙酰NAD)，其在1956年首次得到描述(N.O.Kaplan，J.Biol.Chem.(1956)，221，823)。这种辅酶也显示由酶的弱接受和氧化还原电位中的改变。

WO 01/94370描述了具有经修饰的吡啶基团的进一步NAD衍生物的使用。然而，烟酰胺基团的修饰一般而言对催化反应具有直接影响。在大多数情况下，这种影响是负面的。