[发明专利]一种以硅胶为基质的凝集素高效亲和色谱材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及亲和材料的制备技术，主要为凝集素亲和材料的制备方法，涉及到间隔臂的合成，以及凝集素亲和材料的制备。

背景技术

蛋白质的糖基化是蛋白质翻译后修饰中最重要的修饰之一，生物体中50％以上的蛋白质是糖基化的，糖蛋白参与了细胞免疫，信号传导，蛋白质的翻译调控、癌症等生理过程，在生命体中起着重要的作用(Synthetic glycopeptides and glycoproteins as tools for biology,Chem.Soc.Rev.,2005,34,58-68；Cancer glycan biomarkers and their detection–past,present and future,Anal.Methods,2014,6,3918-3936)。正因为疾病中存在着异常的糖基化现象(Elucidation of N-Glycosites Within Human Plasma Glycoproteins for Cancer Biomarker Discovery,Mass Spectrometry of Glycoproteins,2013,951,307-322)，如岩藻糖增多而唾液酸下降(Fucose and sialic acid expressions in human seminal fibronectin and α 1-acid glycoprotein associated with leukocytospermia of infertile men,Disease Markers，2011,31,317-325)，半乳糖的升高均与疾病相关(Differential Glycomics of Epithelial Membrane Glycoproteins from Urinary Exovesicles Reveals Shifts toward Complex-Type N-Glycosylation in Classical Galactosemia,Journal of Proteome Researc，2012,11,906-916)，所以分析蛋白质的糖基化可以为疾病的临床诊断提供一种方法。

亲和色谱是糖蛋白的分离分析中常用的一种方法。亲和色谱法的突出特点是可对天然生物活性物质进行高特效性的分离和纯化，具有高浓缩效应，可从大量样品基体中分离纯化出所希望获取的少量生物活性物质。这种特效性的产生，是由于在亲和固相基体上，键合连接了特异性的配位体。此配位体的特效官能团可与被分离的生物分子生成具有镶嵌结构的络合物，存在着特效、可逆的分子间相互作用，依据生物识别原理，再利用具有恰当组成、可使镶嵌络合物解离的流动相，经过简单的洗脱步骤，就可实现对目标分子的高纯度、高产率的分离。常见的富集糖蛋白的亲和色谱材料为特异性抗原抗体材料，凝集素亲和材料，硼亲和材料等。

凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。除红细胞外，还能凝集淋巴细胞、纤维细胞、精子等。常用的为植物凝集素。通常以其提取的植物命名，如伴刀豆素A(Conconvalina,ConA)、麦胚素(Wheat germ agglutinin,WGA)、花生凝集素(Peanut agglutinin,PNA)和大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)等，凝集素(Lectin)是其总称。凝集素在动，植物体内广泛存在。迄今为止，已发现的植物凝集素有1000多种。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白、糖脂、特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力。人们逐渐将发现的凝集素发展成强有力的工具来纯化、分离、分析糖蛋白，并将其用于分析组织、细胞和蛋白质的糖结构。

亲和色谱材料的制备及使用中存在的问题。(1)亲和色谱固定相有基体、间隔臂、配位体三部分构成。由于用作基体的载体材料种类繁多；间隔臂具有亲水或疏水性质、长度可以调节；配位体与目标分子作用机理模式多样，因此亲和色谱固定相的制备比其它色谱固定相的制备要复杂，不仅制备程序冗长，且每步键合反应后需检测键合效果，其总体制备成本也较高。(2)常见的亲和材料为凝胶基质，不耐高压，限制了其在高效亲和色谱中的应用，而采用硅胶基质的材料容易解决抗压的问题，但是惰性的材料表面仍然存在非特异性作用，材料表面的电荷作用影响生物大分子和基质间的相互作用。