[发明专利]一种沙门氏菌的快速检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物分子检测技术应用领域，具体涉及一种灵敏度高，特异性强的可视化沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒及其应用。 

背景技术

沙门氏菌(Salmonella spp.)是一类革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界，是常见的人畜共患型致病菌。目前已知的沙门氏菌超过2000种，而且几乎所有的沙门氏菌都能引起严重的食物中毒事件，是导致食物中毒的主要病原菌。据统计，在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。近年来，沙门氏菌在全球范围内引起的危害呈不断上升趋势并造成重大的经济损失。目前沙门氏菌的检测大都沿用传统的细菌培养、生化反应、血清学实验等程序，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法。 

环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法（国际专利公开号WO 00/28082），针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，在1h内能达到10⁹靶序列拷贝，通过荧光染料显色，在自然光下肉眼观察判断结果，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。 

发明内容

本发明的一个目的是在于提供一种可视化沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒。根据沙门氏菌的hilA基因保守区序列设计环介导等温扩增引物，应用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）在线软件设计特异性引物组，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平上实现沙门氏菌的快速检测，为沙门氏菌检测提供了有效且快速的核酸筛查检测方法，可替代传统的沙门氏菌的检测方法，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。 

本发明的另一个目的是在于提供一种可视化沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒的应用，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内，通过对样品简单的处理便可快速检测样品中的沙门氏菌。 

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 

一种可视化沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒

该试剂盒由反应预混液、荧光显色剂、内盖附有灭菌滤纸片的检测管组成，其中的反应预混液包括Bst DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、特异性引物组、甜菜碱和无菌双蒸水。

所述特异性引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-4所示。 

一种可视化沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒的应用

使用方法包括细菌DNA的提取、环介导等温扩增和显色结果判定：

1、细菌DNA的提取：

采用DNA快速提取法，即将样品稀释液煮沸，上清液作为环介导等温扩增反应的DNA模板。

2、LAMP扩增： 

采用25μl反应体系：内引物FIP和BIP各1.6μM，外引物F3和B3各0.2μM，dNTP 1mM，甜菜碱0.5M，硫酸镁6mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，选择64℃避光反应60分钟。

3、检测结果判定： 

将检测管倒置甩动，使反应液与内盖上的滤纸片充分混匀，室温放置2分钟；正置后用力甩动检测管，使管内混有荧光显色剂的反应液聚于检测管底部，在比色卡背景下观察反应液颜色：黄绿色则说明样品中含有沙门氏菌，棕色则说明样品中没有沙门氏菌。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、特异性好，能有效检测样本中是否存在沙门氏菌特定基因片段，进而确定样本中是否存在沙门氏菌；

2、快速高效，能在不到2小时完成检测（不包括样品培养时间）；

3、不需要使用昂贵、精密的仪器设备，只需普通的金属浴或水浴锅，检测成本低；

4、鉴定方便简单，自然光下通过肉眼目测反应液颜色变化即可进行结果判断；

5、整个过程不涉及有毒试剂，保证了操作人员及环境的安全。

附图说明

图1 为本发明试剂盒检测管的俯视图，显示内盖附着的灭菌滤纸片添加了荧光显色剂。