[发明专利]降钙素原抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体的制备方法，特别是涉及一种降钙素原抗体的制备方法。

背景技术

降钙素原（procalcitonin，PCT）是一种糖蛋白质，来自定位于第11号染色体上(11p15，4)的单拷贝基因。PCT是血清降钙素（CT）的前肽物质，PCT前体在内源多肽酶作用下剪掉nPro-CT端单一序列，生成116个氨基酸的PCT，分子量约为13kD。其分子结构为含57个氨基酸的N末端（N-ProCT）、含32个氨基酸CT（Cakitonin）和含21个氨基酸钙抑肽（Katacalcin）组成。在正常生理情况下，PCT是由甲状腺合成与分泌的，其在健康人体的血浆中的含量非常低(小于0.1ng/ml)，但是PCT蛋白在体内的稳定性很好，半衰期大约为20-24h。PCT在人体感染时受内毒素、TNF-α等细胞因子影响在多种组织均可产生，当严重细菌、脓毒症、多脏器功能衰竭时其在血浆中的水平升高，自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高，PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。PCT已被认为是一种用于细菌感染早期诊断、鉴别诊断及治疗监控的最新特异性指标。因此，PCT的检测在临床诊断上有着重要的价值。

目前，临床上对于PCT的检测主要采用免疫学的方法，包括胶体金免疫层析、酶免法、免疫荧光法、免疫化学发光、放射免疫分析法等。而采用这些方法最关键的是获得好用的PCT抗体。由于PCT在正常人血清中含量很低（<0.1ng/ml），临床上的诊断界值一般为0.5ng/ml。因此对诊断用的PCT抗体，除了特异性要好外，对亲和力要求也非常高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种降钙素原抗体的制备方法，其可以获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

步骤一，小鼠免疫，用降钙素原全长表达蛋白免疫小鼠；

步骤二，细胞融合，融合前7-10天复苏小鼠骨髓瘤细胞，放入二氧化碳细胞培养箱培养；

步骤三，单克隆细胞株筛选，融合细胞培养6天后吸取原有培养液，加入200μl新鲜的HAT培养基；

步骤四，单克隆抗体制备。

优选地，所述步骤四选用6-8周龄BLAB/c小鼠，腹腔注射0.5ml石蜡油，1周以后腹腔注射105-106/500μl的9B3细胞；用注射器收集腹水，离心取上清后用GE公司的proteinA预装柱进行纯化；最后获得纯化的降钙素原单克隆抗体。

优选地，所述步骤二采用颈椎脱臼法处死4周龄BALB/c小鼠，按无菌操作取出小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞铺于96孔板。

优选地，所述步骤三在第二天取培养上清，用ELISA法筛选阳性孔。

优选地，所述ELISA法采用ELISA检测板，ELISA检测板制备条件：按50ng每孔的抗原量包被，包被液为碳酸盐缓冲液，封闭液为5%的脱脂奶粉；阳性孔再次更换新鲜培养基，培养1天后再次用ELISA法检测培养上清；选择2次检测都为阳性的孔进行第一次克隆化培养，即通过有限稀释使96孔板平均每个孔只含有1个细胞；7天后，对克隆化培养板细胞培养上清进行ELISA检测，选择阳性孔。

本发明的积极进步效果在于：本发明获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体。

具体实施方式

本发明为了获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体，首先采用的免疫抗原是已经作为抗原制备过羊多抗，并获得了临床可用的多抗。因此本发明的抗原是验证过的抗原。另一方面，本发明在抗体筛选过程中加入了亲和力的筛选，确保得到的抗体具有高亲和力。通过本发明的方法最终获得了特异性好，亲和力高的PCT单克隆抗体9B3、2H5。应用本发明的PCT单克隆抗体9B3、2H5形成双抗夹心酶免法检测50例阳性临床样本结果全部为阳性，可以检测PCT含量为0.1ng/ml的临床稀释样本。

本发明降钙素原抗体的制备方法包括以下步骤：

步骤一，小鼠免疫，用PCT全长表达蛋白免疫6-8周龄BALB/c小鼠，具体免疫方案如下表1所示：

表1

加强免疫结束后3天，采小鼠尾血，利用ELISA法检测小鼠血清效价。经过免疫的小鼠血清效价大多在1:10⁵-1:10⁶左右，本发明选取效价高的小鼠进行下一步细胞融合。