[发明专利]一种甘薯病毒苗的茎尖脱毒方法

权利要求书

1.一种甘薯病毒苗茎尖脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)材料培养：取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，室内培养至萌芽；

(2)材料消毒：剪取生长至1.5～2.0cm长的顶芽进行消毒；

(3)接种培养：从步骤(2)所得顶芽中无菌剥离带2个叶原基的茎尖作为外植体进行接种培养，获得再生植株；

(4)株系建立与病毒检测：对步骤(3)所得再生植株经2～3次继代培养建立株系，依次采用指示植物法和硝酸纤维素膜酶联免疫吸附法进行检测，获得脱毒株系；

(5)快速繁殖：对脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述消毒具体为：先用体积分数为75％的乙醇浸泡25～30s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数0.1％的HgCl₂浸泡8～10min，无菌水冲洗3～5遍。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述茎尖大小为0.22～0.35mm。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述茎尖形态为突起态、半闭合态或闭合态。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述接种培养的培养基由以下成分组成：基本培养基MS，0.8～1.4mg/L BAP，0.01～0.02mg/L NAA；或基本培养基MS，0.2～0.8mg/L BAP，0.1～0.2mg/L IAA。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述接种培养的培养条件为：温度25～30℃，光照强度1600Lx，光照时数12～14h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述检测具体为：以试管苗株系对巴西牵牛用涂抹法和嫁接法观察病毒引起的症状，以巴西牵牛为指示植物进行检测后确认无毒的试管苗株系再用NCM-ELISA法进行检测。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述快速繁殖的培养基由以下成分组成：MS基本培养基，0.1～0.2mg/L IAA，0.1～0.5mg/L GA₃。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述快速繁殖的条件为：温度28～30℃，光照时数12～16h。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)材料培养：选取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，洗净表面后用30～35mg/kg GA₃浸种25～30min，用消毒湿砂覆埋于25～27℃黑暗催芽，当芽露出砂面后用38～40℃热处理7～8d；

(2)材料消毒：剪取生长旺盛的长1.5～2.0cm顶芽，在超净工作台上切去完全展开的叶片，然后消毒；消毒时将材料先用体积分数为75％的乙醇浸泡25～30s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数为0.1％的HgCl₂浸泡8～10min，无菌水冲洗3～5遍；

(3)接种培养：在解剖镜下无菌剥离0.22～0.35mm大小的生长点带2个叶原基，接种在预先制备好的培养基中，培养基组成为：MS基本培养基+0.8～1.4mg/L BAP+0.01～0.02mg/L NAA+0.1～0.2mg/L GA₃；或MS基本培养基+0.2～0.8mg/L BAP+0.1～0.2mg/L IAA+0.1～0.2mg/L GA₃；培养条件为：培养温度26～28℃，光照强度1500～1600Lx，光照时数12～14h；

(4)株系建立与病毒检测：对来自不同品种/品系的茎尖初代培养建立的试管苗严格按株系序号进行继代培养建立株系，病毒检测先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牵牛植株叶片生长数日后观察引起的症状来鉴定，不出现症状得到无病毒的株系，再用NCM-ELISA法检测，其检测程序为：样品采集→在膜上点样→加入封阻液→冲洗→添加特异病毒抗体→冲洗→加入酶标抗体→冲洗→显色→终止反应，得到无紫色反应的脱毒株系；

(5)快速繁殖：快速繁殖培养基组成为MS基本培养基+0.1～0.2mg/L IAA+0.1～0.5mg/L GA₃；在28～30℃、12～16h/d条件下对步骤(4)所得脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。