[发明专利]一种低拷贝pTerm质粒及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种低拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述质粒由rop基因、rep基因、原核生物转录终止子、多克隆位点以及抗生素抗性基因组成；在所述多克隆位点的两端分别设置至少一个所述原核生物转录终止子；所述原核生物转录终止子为不依赖ρ因子的原核生物转录终止子；所述抗生素抗性基因为Amp基因或Kan基因。

2.根据权利要求1所述的低拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述Amp基因如SEQ ID No.1所示的序列结构，所述Kan基因如SEQ ID No.4所示的序列结构。

3.根据权利要求1或2所述的低拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述质粒的拷贝数为40-60个。

4.根据权利要求3所述的低拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述质粒记为pTerm-LA，如SEQ ID No.7所示的序列结构；所述质粒中，自5’端第120bp～713bp为Terminator基因；869bp～1729bp为Amp基因；1878bp～2506bp为rep基因；3231bp～3455bp为rop基因；其中多克隆位点在427bp～468bp处；或者

所述质粒记为pTerm-LK，如SEQ ID No.8所示的序列结构；所述质粒中，自5’端第120bp～713bp为Terminator基因；869bp～1684bp为Kan基因；1833bp～2461bp为rep基因；3186bp～3410bp为rop基因；其中多克隆位点在427bp～468bp处。

5.一种构建根据权利要求1-4任一所述的低拷贝pTerm质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：人工设计并合成rep基因、rop基因、含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段以及抗生素抗性基因片段；所述含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段中在所述多克隆位点的两端分别设置至少一个所述原核生物转录终止子；

步骤二：运用多段重组法将所述的rep基因、rop基因、含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段以及抗生素抗性基因片段连接环化，最终得到环形的质粒。

6.根据权利要求5所述的低拷贝pTerm质粒的构建方法，其特征在于，所述的多段重组法为Gibson重组方法，反应体系及条件：按1:1:1:1的摩尔比取所述rep基因、rop基因、含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段以及抗生素抗性基因片段，加入灭菌去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂，50℃下反应至得到环形质粒。

7.一种构建权利要求1-4任一所述的低拷贝pTerm系列质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：人工合成所述抗生素抗性Amp基因或Kan基因片段；

步骤二：按照权利要求5或6所述方法构建得到含所述抗生素抗性Amp基因或Kan基因的pTerm质粒，分别以所述含抗生素抗性Amp基因或Kan基因的质粒为模板，F-pTerm-LA/LK、R-pTerm-LA/LK为引物,通过PCR扩增得到rop-rep-含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段；所述引物F-pTerm-LA/LK：5’-ctgtcagaccaagtttactcatatatactttag-3’；所述引物R-pTerm-LA/LK：5’-actcttcctttttcaatattattgaagcatttatc-3’；所述含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段中在所述多克隆位点的两端分别设置至少一个所述原核生物转录终止子；

步骤三：运用Gibson重组方法，将构建的所述rep-rop-含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段分别与所述抗生素抗性Kan基因或Amp基因片段进行组装。

8.根据权利要求7所述的低拷贝pTerm质粒的构建方法，其特征在于，所述的Gibson重组方法反应体系及条件：按1:1的摩尔比取所述rep-rop-含有原核生物转录终止子和多克隆位点的基因片段分别与所述抗生素抗性Kan基因或Amp基因片段，加入灭菌去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂，50℃下反应至得到环形质粒。

9.权利要求1-4任一所述低拷贝pTerm质粒在基因克隆、筛选和测序领域中的应用。