[发明专利]生鲜果蔬食品中致病菌检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域 本发明涉及一种食品中致病菌快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术 水果蔬菜中富含人体必需的维生素、有机酸、无机盐和植物纤维等营养成分，而即食生鲜果蔬食品因为食用方便、口味清新和味道鲜美，更是人们日常生活中和餐桌上常见的食物。但是，生鲜果蔬食品仅经简单清洗，未经高温杀菌处理，其表面和内部附着的微生物，尤其是金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌等水果蔬菜中常见的致病菌因而可能部分残留，对生鲜果蔬食品的食用安全性造成了极大的隐患。因而，对生鲜果蔬食品中致病菌的快速、准确的检测和鉴定技术就显得格外重要了。目前，我国对生鲜果蔬食品中致病菌的检测仍以常规的微生物学检测和鉴定方法为主。它的不足之处：费时、费力，且难以快速、准确的进行检测，检测成本高。

发明内容 本发明的目的是提供一种省时、省力，且能够快速、准确的进行检测，节约检测成本的生鲜果蔬食品中致病菌多重聚合酶链式反应检测试剂盒。

本发明所述的检测试剂盒，其中各组分组成及浓度为：⑴检测金黄色葡萄球菌的引物：上游引物5’-TGC GAA ACA TCC ACG ACA TA-3’，下游引物5’-CGT TTG TGC TGA TTT CCC TAC-3’，浓度为0.5～2.0μmol/L⑵检测沙门氏菌的引物：上游引物5’-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3’，下游引物5’-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3’，浓度为0.5～2.0μmol/L，⑶检测大肠杆菌的引物：上游引物5’-GGC GGA TAA GAC TTC GGC TA-3’，下游引物5’-CGT TTT GGC ACT ATT TGC CC-3’，浓度0.5～2.0μmol/L，⑷镁盐，浓度为1.0～2.0μmol/L，⑸脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，浓度为0.15～0.25μmol/L，⑹10×聚合酶链式反应(PCR)反应缓冲液5.0μL，⑺水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶1.0～3.0U，用灭菌无离子水补足体积至50.0μL。其中，镁盐为氯化镁或硫酸镁。

应用上述试剂盒对生鲜果蔬食品中致病菌进行检测的方法具体如下：

(1)无菌操作取样品放入无菌均质袋(内含100mL无菌生理盐水)中在均质仪上拍打混匀，取1.0mL样液无菌操作涂于LB肉汤固体平板，37℃恒温培养24h。在无菌条件下将单菌落分别挑入各灭菌离心管中，分别加50μL Lysis Buffer细胞裂解液，80℃水浴裂解20min，1000r/min离心10min，取上清作为聚合酶链式反应(PCR)模板液；

(2)将待检样品菌体制备的基因组DNA模板添加到检测试剂盒中，试剂盒内各组分组成及浓度为：检测金黄色葡萄球菌的引物0.5～2.0μmol/L，检测沙门氏菌的引物0.5～2.0μmol/L，检测大肠杆菌的引物0.5～2.0μmol/L，镁盐1.0～2.0μmol/L，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.15～0.25μmol/L，10×聚合酶链式反应(PCR)反应缓冲液5.0μL，水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶1.0～3.0U，用灭菌无离子水补足体积至50.0μL。各致病菌DNA模板各3μL，按现有技术，在聚合酶链式反应(PCR)扩增仪(Thermo Scientific，型号：Arktik)上孵育，聚合酶链式反应(PCR)循环参数为95℃预变性3min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，循环32次；72℃终延伸10min，结束聚合酶链式反应(PCR)扩增；

(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，取扩增后的产物5μL点样于1％琼脂糖凝胶，其中含0.5μg/mL嗅化乙锭，以1000bp Marker为标准分子量参照，以5V/cm的电场强度于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳30min，电泳结果用紫外凝胶成像系统拍照和分析，待检样品与阳性对照同时扩增出426bp的条带，则判定为金黄色葡萄球菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出284bp的条带，则判定为沙门氏菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出151bp的条带，则判定为大肠杆菌阳性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明针对生鲜果蔬食品中主要致病菌而设计，一次可检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌三种致病菌，检测时间由常规检测的3-5天，缩短为聚合酶链式反应(PCR)检测的30小时以内，省时省力，节约检测成本。

附图说明

图1为本发明试剂盒对实施例1的检测结果图。

具体实施方式