[发明专利]一种高拷贝pTerm质粒及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域和基因工程领域，具体地涉及一种高拷贝pTerm系列质粒及其构建方法和应用。

背景技术

质粒是染色质外的遗传因子，能够进行自主复制，是一种能独立复制的复制子。质粒是一种双链共价闭合环形DNA分子，可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2kb～300kb之间。

质粒虽然不是宿主生存所必需的遗传元件，但是能够给予宿主细胞某些特殊的性质，例如抗药性等。质粒可以作为载体用于克隆外源基因，广泛应用于基因克隆、测序及基因合成等领域。人们一方面不断从自然界发现新质粒，另一方面也不断在已有质粒的基础上构建衍生质粒，作为基因工程的载体。

所谓复制子，即是一个遗传单位，包括DNA复制起点(ori)及其相关的调控原件。每个质粒DNA上都含有ori，在质粒中ori是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，只有ori能被宿主细胞复制及蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与ori的序列结构相关。

根据质粒复制的特点，质粒被分为严紧型和松弛型两类。严紧型质粒也称低拷贝数质粒，每个细胞中拷贝数有限，大约一个至十几个；松弛型质粒也称高拷贝数质粒，其拷贝数较多，可达几百个。恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞遗传背景及生长条件有关。尤其是高拷贝数质粒更是因其分子量小、拷贝数高、操作方便、易于大量制备等优点而成为实验中的首选。

松弛型质粒(高拷贝数质粒)通常带有蓝白斑筛选功能(例如pUC系列载体)，这个特点给基因克隆带来了极大的方便。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz＇的基因，lacz＇中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子序列；编码α肽链的序列；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的序列中，是外源DNA的插入位点。设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽(即α肽链)，从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用，能够使X-gal生成蓝色物质，这种现象即α-互补。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生有活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型呈现白色菌落。

虽然带有蓝白斑筛选功能的高拷贝数质粒给基因克隆提供了极大的方便，但是其β-半乳糖苷酶的启动子属于强启动子，能够大量启动外源基因的转绿、翻译，这就导致结构复杂的基因、转录或翻译产物对宿主有毒性的基因无法克隆。因此，如何克服现有质粒载体存在的上述缺陷，提高克隆“难度”基因的成功率是很多科研人员需要解决的首要问题。

发明内容

本发明解决的问题在于现有技术中高拷贝数质粒存在的诸多缺陷，进而提供一种没有蓝白斑筛选功能及相应的强启动子，并且MCS两端添加多个原核生物转录终止子的高拷贝数质粒，所述质粒能够有效遏制外源基因的转录、翻译，从而使该质粒能够成功克隆“难度”基因。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种高拷贝pTerm质粒，包括colE1复制子基因、原核生物转录终止子以及抗生素抗性基因；所述原核生物转录终止子设置于多克隆位点的两端；所述抗生素抗性基因为bla基因或Kan基因中的任一种。

优选的，所述bla基因具有如SEQ ID No.1所示的序列结构，所述Kan基因具有如SEQ ID No.4所示的序列结构。

优选的，所述质粒的拷贝数为380-560个。

优选的，所述质粒记为pTerm-HA，具有如SEQ ID No.7所示的序列结构；所述质粒中，自5’端第22bp～615bp为Terminator基因；961bp～1821bp为bla基因；1916bp～2598bp为colE1复制子基因；其中多克隆位点在329bp～370bp处；或者，