[发明专利]纳米粒子表面用DNA四面体为支架并引滚环扩增反应的方法

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料功能化及DNA纳米技术应用领域，涉及一种DNA自组装而成的DNA四面体作为支架组装在纳米材料表面，且DNA四面体上延伸出的一段单链DNA引发滚环扩增反应，所得产物为纳米粒子表面负载多条特定识别性能的长单链DNA，此结构可用于细胞检测、捕获及细胞成像等研究。

背景技术

恶性肿瘤目前已成为世界上死亡率最高的重大疾病之一， 而随着肿瘤发病率的日趋升高，人们针对恶性肿瘤的认识和研究的研究也在不断加深：早期、高效和特异性的CTC 捕获不仅是肿瘤的早期诊断的一个有力手段，同时通过释放所获CTC 并针对其生物学特性进行深入研究，也有利于肿瘤转移发生以前的风险评估和治理方案的制定。 而目前针对CTC 的捕获技术却存在一些问题，如因CTC 数量稀少原因而捕获技术效率不高从而导致CTC 较难检测到；另外，捕获过程中对CTC 活性产生一定损伤，影响其后期的生物学特性研究等。因此，如何实现CTC 的高效捕获和有效释放得到生物学特性完全的CTC 是目前肿瘤转移研究中亟待解决的生命科学问题。

肿瘤特异性Aptamer（核酸适配体）的研究近年来逐渐兴起和不断丰富，它是用配体指数富集法系统进化（SELEX）技术筛选获得一段单链DNA 或RNA，借其自身形成的空间结构与靶标分子特异性识别，具备靶分子广、亲和力高、特异性强、易改造修饰等传统生物抗体所不具备的诸多优越性能，为肿瘤靶向研究和治疗提供了一类理想的靶向识别分子。但同时，虽然组装在材料表面的aptamer 可以特异性地识别肿瘤细胞表面受体，由于磁性纳米粒子表面有限的组装面积以及aptamer 在粒子表面可能的倒伏组装状态均使得CTC 的识别和捕获效率有待提高。 滚环扩增技术可以使组装在纳米材料表面DNA 序列实现复制，并得到长的单链DNA 产物，且单链DNA 产物由一重复片段组成。但纳米材料表面的DNA 密度控制不当， 不仅导致扩增效率不高，而且所获长单链DNA 产物相互缠绕，并导致聚集使得受体识别变得困难。 

而DNA 四面体为DNA 的扩增问题提供了可能的解决路径。它是由六条DNA 单链配对而成，具有高结构稳定性和刚性。研究表明，DNA 四面体可以有效提高DNA 探针在表面分布排列的均一性，并精确调控探针之间的距离，从而显著提高了生物检测的灵敏度和特异性。因此将可在充分利用和发展纳米技术特有的优势的基础上，有望为肿瘤的早期诊断提供新的高效检测手段并为研究肿瘤的转移发生和发展等生命科学问题提供有力的理论基础和技术依据。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种在纳米材料表面用DNA四面体作为反应支架并引发滚环扩增的方法。

本发明的目的之二是通过滚环扩增技术，扩增得到多aptamer结构的长单链DNA，用于CTC的高效捕获。

一种纳米粒子表面用DNA四面体为支架并引发滚环扩增反应的方法，其特征在于，制备好的DNA四面体组装在纳米粒子表面后，DNA四面体上延伸出的一段单链DNA可作为引物DNA，使用与特定aptamer序列互补的环形DNA作为扩增模板，与引物DNA杂交并引发滚环扩增反应，制备的产物为纳米粒子表面多apatmer结构组成的多条长单链DNA，通过aptamer与细胞表面特定受体的结合从而用作细胞检测、捕获及细胞成像探针。

所述的DNA四面体为四条单链DNA通过DNA杂交，自组装而成的一种四面体结构。

所述的纳米粒子为纳米金、量子点、磁性纳米粒子中的一种。

所述的DNA四面体组装在纳米粒子表面为巯基修饰的DNA四面体通过Au-S键，或NH₂-修饰的DNA四面体通过缩合反应等组装在纳米金表面或有含-COOH基的纳米粒子表面。

所述的延伸的一段单链DNA，为10-30个碱基的一段DNA序列。

所述的特定aptamer序列为在受体存在的情况下可与其特异性结合的一段DNA序列，如可与循环肿瘤细胞表面受体（EpCAM）结合的aptamer结构。

所述的扩增模板为含有一段非aptamer互补的DNA无关序列。

所述的多apatmer结构组成的多条长单链DNA为aptamer结构与无关序列间隔出现的DNA单链，无关序列可降低aptamer与受体结合的位阻效应。

本发明可有效调控纳米粒子表面DNA的分布密度从而提高引物DNA与环DNA的杂交效率，构建功能高效的生物探针用于细胞检测、捕获及细胞成像领域。

具体实施方式

实施例1：