[发明专利]基于SSR扩增反应方法的棉花DNA一步快速提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说，本发明具体涉及一种棉花一步法DNA快速提取的方法。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物之一，国内外已对其开展了大量的分子辅助育种等方面的研究。目前，水稻、玉米、油菜等其他作物的分子辅助育种研究已相当深入，而棉花分子辅助育种则明显滞后，其中一个主要原因是其DNA 的提取较其他作物困难^[1]。基于DNA 变异的分子标记技术——SSR，因具有共显性，多态性丰富，重复性好等优点，已经在棉花育种中得到了广泛的应用。DNA提取是SSR_PCR检测的前提，但因棉花中富含多酚、多糖和蛋白质等干扰物质，使得提取棉花DNA较其他植物困难^[2]。传统的CTAB法、SDS法等，虽能提取到较高质量棉花DNA，但由于操作过于繁杂而不能高效地运用SSR技术。尽管植物提取基因组DNA 的方法很多^[3-4] ,最常见的提取方法是SDS 法和CTAB 法，多数植物对这两种方法基因组DNA 的提取均比较有效 ^[5]。

棉花富含棉酚、多糖、单宁等其他干扰物质。在细胞破碎时，棉酚等多酚类物质自动氧化，然后与蛋白质、核酸等形成复合物，从而影响DNA 的获得率^[6]。近年来，很多学者试图找出一种快速提取棉花总DNA 方法。现已报道的方法有CTAB 法、SDS法、PVP40 法、氯仿－异戊醇法以及β-巯基乙醇法等^[7-8]。利用上述方法尽管可以成功的提取到棉花DNA，不同方法的DNA得率也不尽相同。其基本操作步骤是棉花叶片液氮研磨粉碎，加裂解液裂解，然后分别酚/氯仿和氯仿/异戊醇进行抽提，上清液加入异丙醇沉淀等，置无菌台吹干；用双蒸水溶解DNA沉淀，4℃保存备用^[6-9]。目前上述棉花的DNA 提取步骤比较复杂，DNA 提取费时费力。

棉花叶片中富含蛋白质、棉酚、多聚糖等干扰物质。在研磨细胞时，细胞内的多酚类物质易氧化，氧化后的物质易与核酸形成复合物，使DNA提取液带有褐色，而此复合物一旦形成，就很难再解离。自Stephen L.Dellaporta等（1983）报道SDS（Sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠）法、Scott O.Rogers等（1985）报道CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）法以来，已成为提取棉花DNA的基本方法。近年来，有很多学者对棉花DNA的提取方法进行探索和研究^[8-11]，取得了一定的成就。但基本上都是基于CTAB法和SDS法的改良，效率提高的空间很小，所使用的化学试剂也无太大变化。目前国内外尚未见一步法成功提取棉花DNA，并有效用于棉花SSR反应。

参考文献如下：

[1]蓝海燕, 刘桂珍, 王长海, 等. 棉叶总DNA 提取的改良方法[J]. 棉花学报, 2000, 12( 1) : 53.

[2] 宋国立, 崔荣霞, 王坤波, 等. 改良CTAB 法快速提取棉花DNA[ J]. 棉花学报, 1998, 10(5) 273- 275.

 [3] Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB. A plant DNA minipreparation: vertion [J]. Plant Mol Bi ol Rep, 1983, 1(4) : 19- 21.

[4] Pich U, Schubert I. Minipreparation method for isolat ion of DNA from plants with a high content of polyphenolics [J] . Nucl ei cAcids Research, 1993, 1(14) : 3328- 3332.

[5] Murry HG, Thompson WF. Rapid isolat ion of high molecularweight plant DNA [J]. Nucl ei c Acids Res , 1980, 8: 4321 -4325.

[6]沈法富, 于元杰, 刘凤珍, 等. 棉花核DNA 的提取及其RAPD 分析[J]. 棉花学报, 1996, 8(5) : 246- 249.