[发明专利]Cas9-scForkI融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种Cas9-scForkI融合蛋白及其应用。

背景技术

CRISPR-Cas源自细菌和古细菌的免疫系统，可利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行修饰。RNA导向Cas9可以在多种细胞和生物体中发挥功能，在特异位点裂解完整基因组。Cas9这种基因组编辑的潜能使这项技术已经广泛用于人的细胞系，小鼠，大鼠，多物种的基因敲除及敲入。

ForkI是一种限制性核酸内切酶，ForkI二聚化后就可以对DNA进行切割。已经有文献报道，失活的Cas9与ForkI融合，即Cas9-ForkI可用于基因组的编辑。而且Cas9-ForkI nickase可以更精确的用于基因组的编辑。但是这两个技术需要设计两个gRNA靶向，设计比较复杂。而且Cas9-ForkI nickase的切割效率也比较低。本发明用一个失活的Cas9蛋白连接两个ForkI，这两个ForkI由(G4S)₁₀连接，该方法设计比较简单，只需要设计一个gRNA，而且切割活性很高。该方法更适用于介导基因敲入。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种Cas9-scForkI融合蛋白。本发明通过基因工程的办法，把人源化Cas9蛋白进行改造，用(G4S)₁₀即(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₁₀是一个linker，由它连接两个ForkI显示，然后和失活的Cas9融合成Cas9-scForkI，该融合蛋白可以序列特异性的进行基因组的编辑。

本发明采用的技术方案如下：

Cas9-scForkI融合蛋白，所述融合蛋白为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白。

编码上述的Cas9-scForkI融合蛋白的核苷酸序列。

以上核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的Cas9-scForkI融合蛋白，所述的Cas9蛋白是失活的Cas9。

所述的Cas9-scForkI融合蛋白，所述的scForkI蛋白是由两个ForkI，中间由一个(G4S)₁₀连接。

所述的Cas9-scForkI融合蛋白在药物筛选及基因修饰中的应用。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明通过基因工程的办法，把失活的Cas9蛋白进行改造，用(G4S)₁₀即(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₁₀是一个linker，由它连接两个ForkI，然后和失活的Cas9融合成Cas9-scForkI，该融合蛋白可以序列特异性的进行基因组的编辑。本发明Cas9-scForkI融合蛋白做药物筛选或基因修饰更安全，该融合蛋白还可用于基因治疗。

本发明和现有技术相比较，设计更加灵活。而且切割活性更高，用作基因敲入的效率更高。蛋白不仅可以用于基因修饰，也可用于基因治疗。

附图说明

图1为Cas9-scForkI蛋白活性的验证图；

图2为Cas9-scForkI蛋白对Malt1基因切割活性验证图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明中，SEQ ID NO.8所示序列、引物Primer_F1 、引物Primer_ R1、Malt1基因的gRNA序列、引物Primer F、引物Primer R、引物Primer_F2和引物Primer_ R2，均购于生工生物工程（上海）股份有限公司；

胶回收采用胶回收试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司；

hCas9载体购于Addgene，Plasmid 41815；

小鼠ES细胞，购于Millipore；

以SEQ ID NO.8所示合成Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI DNA序列是委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。

实施例1  Cas9-scForkI融合蛋白的制备