[发明专利]一种用于核酸分离和纯化的磁流体的制备方法

说明书

 

技术领域

    本发明属于磁性颗粒的制备领域，具体涉及一种用于核酸分离和纯化的磁流体的制备方法。

背景技术

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA）。DNA 和RNA 在动植物种都有存在，但一种病毒只含有一种核酸，DNA 或RNA。核酸在整个分子生物学中的所具有的无可替代的作用，分子生物学创立以来，一直是分子生物学研究的主要对象。因此，核酸的提取和分离纯化也是分子生物学各类实验不可缺少的一个环节。

大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。它的基因组DNA为拟核中的一个环状分子,同时可以有多个环状质粒DNA。正由于大肠杆菌的上述优点，人们在利用大肠杆菌表达外源基因时，常常有质粒提取的操作。目前人们常用的质粒提取的方法是采用酚氯仿抽提质粒DNA，然后用异丙醇或乙醇沉淀，此方法中需要用到酚氯仿这些有毒物质，对实验操作人员造成潜在危害。为改善实验人员的工作环境，目前人们采用商业的DNA回收柱来进行质粒提取，此类DNA回收柱价格昂贵，回收柱的使用是一次性的，造成大量实验室固体垃圾。

在基因克隆实验中，也常常将基因通过扩增后，从琼脂糖凝胶中回收目的基因。从琼脂糖凝胶中回收的方法很多，如阴离子交换色谱纯化、电洗脱至透析袋、有机溶剂抽提、琼脂糖酶消化、柱式树脂吸附系统回收等，方便快捷的回收方法及较高的回收效率在分子克隆中是十分重要的。采用市售回收试剂盒，价格较昂贵，且回收效率不稳定；并且回收柱是一次性的，造成大量的生物实验耗材垃圾；目前市场上的DNA回收柱的容积一般是2mL，当需要大量回收DNA时，需要操作人员用多个回收柱进行回收，不仅造成实验成本高，并且提高操作人员的工作量。

方便快捷的核酸分离和纯化方法，在基因遗传工程中十分重要。利用磁流体分离和纯化核酸具有以下好处：磁性粒子具有超顺磁性, 在磁场中有较强的磁性, 去掉磁场后磁性很快消失, 在磁场中不被永久磁化, 故可在外加磁场(如磁铁)作用下, 快速、方便地分离和纯化目标核酸。目前的磁流体制备成本高，磁性粒子在缓冲溶液中的稳定性差，放置1个月、甚至几天后，其分离和纯化效果降低，这些都限制了磁流体在核酸分离和纯化操作中的广泛使用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种用于核酸分离和纯化的磁流体的制备方法，制备而成的磁流体磁响应性好，在不同缓冲液中对核酸的吸附和解吸效果佳，能方便迅速地实现核酸的分离或纯化。本发明采用如下技术方案：

    一种用于核酸分离和纯化的磁流体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a、将氯化铁、氯化亚铁和氨水分别配制成水溶液，然后搅拌混合，得到混合液A；

b、向混合液A中逐滴加入油酸，继续搅拌3~10h，得到黑色溶液A，用外加磁场从黑色溶液A中分离得到黑色固体A；

c、将黑色固体A分散在去离子水中，加入聚醚酰亚胺，超声振荡5~12h，得到黑色溶液B，用外加磁场从黑色溶液B中分离得到黑色固体B；

d、将黑色固体B分散在去离子水中，即得所述的磁流体。

优选地，步骤a中所述的氯化铁、氯化亚铁和氨水的水溶液的混合比例按溶质的摩尔份数计，为2：1：8。

优选地，步骤a中所述的搅拌混合时间为5~10h；所述的搅拌混合的同时采用油浴加热，加热温度为30~50℃。

    优选地，步骤b中所述的用外加磁场从黑色溶液A中分离得到黑色固体A包括以下内容：从黑色溶液A中用外加磁场收集固体后，用无水乙醇清洗固体2~3次，然后用去离子水清洗固体直到清洗液的pH=6.7~7，用外加磁场收集固体，即为所述的黑色固体A。

优选地，步骤d中所述磁流体的浓度为2~50mg/ml。

本发明的有益效果如下：

1. 本发明提供的用于核酸分离和纯化的磁流体的制备方法中，采用油酸对四氧化三铁表面进行修饰，对纳米粒子进行包覆，使外表面形成保护层阻止粒子团聚，使制备而成的磁流体粒径为纳米级的，在溶液中的分散性好，增大与核酸的接触面积。

2. 本发明提供的用于核酸分离和纯化的磁流体的制备方法中，采用聚醚酰亚胺对磁性粒子进行表面改性，得到表面有氨基修饰的磁性粒子，便于对核酸的分离和纯化。