[发明专利]一种靶向酵母线粒体的穿梭载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种靶向酵母线粒体的穿梭载体及其应用。

背景技术

线粒体是一种半自主细胞器，其中含有线粒体DNA（mtDNA），能够进行自主复制。根据前人的研究，酿酒酵母线粒体DNA中有8个潜在的复制起始序列（Origin of Recognition，ori）或复制子（replicon）（Tracy R L et aL, Current genetics, 1995, 28(3): 205-216）。1941年就有研究者使用氰化物处理酵母菌，第一次发现了酿酒酵母的呼吸突变现象，随后发现了酿酒酵母小菌落突变型（petite mutant），该突变表现为酿酒酵母在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium ，YPD或YPED）上生长产生的菌落较正常菌落小。而随后的研究发现，该小菌落突变型往往表现为线粒体功能的下降甚至完全缺失，其中有些突变类型涉及到线粒体基因组突变，一般是线粒体基因组编码基因的大量缺失突变，导致线粒体蛋白合成障碍，进而导致线粒体呼吸链破坏引起线粒体氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation ，OXPHOS）水平下降。从而在平板上表现为菌落变小。

随后的研究者从酵母小菌落突变型中扩增获得含有自主复制序列样片段（autonomously replicating like sequence，ARS‐like）（Delouya D et aL, Yeast, 1991, 7(1): 51-60），研究者一般使用一种称为超抑制小菌落（supersuppressive petites）的技术，通过自发突变获得的线粒体突变体，该突变体含有一种缺失突变线粒体，因为不能合成线粒体所需的蛋白质，但是可以正常完成突变的线粒体DNA的复制，因此含有复制起始序列。通过对该缺失突变DNA进行分析，获得预测的复制子序列，利用酵母菌杂交技术与含有正常线粒体的酵母株进行杂交，在杂交后代中出现小菌落的数目和抑制程度，称为抑制率。因此，如果缺失突变体中含有的复制子复制能力越强，那么我们可以推断其抑制率越高。对诱变获得的不同突变株进行的研究最终获得8种潜在复制子功能的序列。

该方法通过子代中缺失突变体和正常线粒体基因组复制竞争，推断突变体中共同含有的复制子序列，是一种有效研究复制子功能的方法。然而该方法属于非直接的方法，这样获得的复制子仅属于推断，虽然之后的获得复制子通过序列分析，发现有高度同源序列。然而并没有直接的对线粒体复制子进行功能研究。

发明内容

本发明的目的是为了解决如何利用分子生物学手段对线粒体复制子进行功能研究，提供了一种经过密码子优化的靶向酵母线粒体的穿梭载体，该穿梭载体包括大肠杆菌的质粒复制子、大肠杆菌抗性筛选基因、酵母线粒体启动子、酵母线粒体复制子、酵母的抗性筛选基因。

所述大肠杆菌质粒复制子是pMB1、p15A、pSC101、ColE1或pWV01。

所述大肠杆菌抗性筛选基因是氨苄青霉素基因、四环素基因、氯霉素基因、卡那霉素基因、新霉素基因或红霉素基因。

所述酵母线粒体启动子是p75或P_oxi1。

所述酵母线粒体复制子是ori1、ori2、ori3、ori4、ori5、ori6、ori7或ori8。

所述酵母抗性筛选基因是新霉素基因、Zeocin基因、氯霉素基因、Neocin基因或G418基因。

所述靶向酵母线粒体的穿梭载体核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明另一目的是将靶向酵母线粒体的穿梭载体应用在酵母线粒体转化中。

（1）本发明提供了一种利用密码子优化技术对氯霉素抗性基因（CAT）进行优化方法，使得外源基因能够在线粒体中特异性表达。

（2）本发明通过上述方法进行优化后，提供了用于构建线粒体穿梭载体方法。

（3）基于构建的线粒体穿梭载体，克隆线粒体复制子ori5并构建到上述载体，验证了其具有线粒体复制子功能。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明使用一种直接的方法验证了线粒体复制子功能；比超抑制小菌落技术，提供了更为直接的分子生物学手段验证线粒体复制子功能；

2、利用该载体可以根据本发明中提供的密码子优化方案对外源蛋白在线粒体中表达提供方法；