[发明专利]一种稳定高效表达鸡防御素10的细胞系及复合制剂及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种稳定高效表达鸡防御素10的细胞系及复合制剂及应用。

技术背景

我国是禽类产品出口大国，养禽业的健康发展不仅关系到广大养殖户的经济利益，还关系到国民的身体健康。然而，由于抗生素的滥用，导致检测出药物残留量超标，严重威胁食品安全问题，同时也产生了大量的耐药菌株，这给养禽业的疾病防控和治疗工作带来了严重的阻碍。为了养禽业的健康发展，我们亟需寻找到一种新的途径或者新的方法，防止耐药性的出现和食品安全等问题。因此寻找和开发无耐药性的新型抗菌药物具有非常重要的现实意义(Miyasaki，1998)。

防御素(defensin)又名嗜中性多肽(Neutrophil Peptides，NP)，是一类对抗外源性病源茵的防御性肽类活性物质，是生物机体免疫系统的一个重要组成部分，在动物、植物、昆虫体内广泛存在，具有广谱抗菌功能(Tang，1999)。研究表明，各种防御素对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、分枝杆菌、霉菌、真菌、囊膜病毒及肿瘤细胞有不同程度的抑制作用(Salz man，2003)。Gallinacin是广泛存在于鸡体内的一种β-防御素，在鸡防御系统中有重要作用，具有很强的抗细菌活性和广泛的抗菌谱，提示我们可以将其开发为一种新的抗微生物制剂。因此，鸡防御素的成功获取能带来极大的社会、经济效益。但鸡体内天然防御素表达量低、分子小,分离困难,化学合成防御素成本又太高,所以利用基因工程技术重组表达外源基因已成为获取目标蛋白的有效途径之一(Chen，2001)。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种稳定高效表达鸡防御素10(Gallinacin-10，本发明或称Gal-10)的细胞系，该细胞系已于2014年11月7日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：猴胎肾细胞MARC145/Gal-10,保藏编号：CCTCC NO：C2014208。地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了猴胎肾细胞MARC145/Gal-10细胞系表达的重组鸡防御素10，该防御素具有显著的抗菌活性，安全性好。

本发明还有一个目的在于提供了一种鸡防御素复合制剂，该制剂是由鸡防御素8和鸡防御素10混合制得，所述的鸡防御素8由猴胎肾细胞MARC145/Gal-8(CCTCC NO：C2014207)细胞系表达得到，鸡防御素10由猴胎肾细胞MARC145/Gal-10(CCTCC NO：C2014208)细胞系表达得到。

本发明还有一个目的在于提供了猴胎肾细胞MARC145/Gal-10细胞系在制备抑菌药物中的应用，包括在制备生物防腐剂，生物抑菌剂中的应用，还包括用于制备家禽生物药品中的应用，特别是在制备鸡细菌感染性疾病药物中的应用。

本发明还有一个目的在于提供了一种鸡防御素复合制剂在制备抑菌药物中的应用，包括在制备生物防腐剂，生物抑菌剂中的应用，还包括用于制备家禽生物药品中的应用，特别是在制备鸡细菌感染性疾病药物中的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种能稳定高效表达鸡防御素8的细胞系，其制备方法如下：

(1)从15日龄的仔鸡体内采集新鲜的鸡肾组织，提取鸡组织总RNA。反转录的cDNA产物用DNaseⅠ37℃处理20min以去除基因组DNA污染；

(2)根据鸡防御素8基因序列，PCR扩增鸡防御素8，设计引物如下：

P8-1：5’CGGAATTCATGAAGATCCTTTACCTTCTCTTGG 3’

P8-2：5’CGGGATCCTTAGTCGTACACAGTCCGGCA 3’

(3)用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鸡防御素8和pIRES2-EGFP，将防御素8基因连接到载体pIRES2-EGFP，获得重组质粒pIRES2-EGFP-GAL-8，用于细胞转染。