[发明专利]一种C反应蛋白定量测定试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医疗器械生物类免疫体外诊断领域，具体涉及一种基于磁微粒分离化学发光法定量检测血液中C反应蛋白的试剂盒及其制备方法，以及应用该试剂盒定量检测血液中C反应蛋白的方法。

背景技术

血清CRP水平是指示细菌感染的一项敏感而客观的指标。细菌感染时，血清CRP的水平可以中度或明显升高，阳性率可达90％以上；而病毒等感染时CRP水平多正常或轻度升高，因此可以帮助细菌感染与非细菌感染的鉴别诊断。此外，定量测定脑脊液、胸腔积液中的CRP水平亦可以对脑膜炎、胸膜炎的鉴别诊断有一定意义；不仅如此，CRP水平还与感染范围和感染严重程度有一定关系。另外，血清CRP水平还可以用来预测感染性疾病的严重程度、住院时间的长短、预后及复发。CRP还可以反映动脉粥样硬化斑块的成分并预测斑块破裂的可能性，是心血管疾病的独立预测因子。冠心病、急性冠脉综合征患者CRP往往明显升高，如心肌梗死患者中血清CRP可以急剧上升，其升高水平与冠状动脉梗阻程度、冠心病终末事件的发生及预后、充血性心力衰竭的程度等均有显著相关性。目前，CRP已经成为健康人及冠脉疾病患者心血管疾病风险的预测因子之一，也是监测疾病治疗效果的指标之一。

在国内，C反应蛋白(CRP)检测临床上主要以国外进口试剂和免疫组化试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。具有自主知识产权的国产C反应蛋白(CRP)免疫化学发光检测试剂盒目前还较少，也仅停留在96孔微孔板式技术水平上。该技术灵敏度较低、线性窄、特异性较差，也不利于高通量的全自动检测。

因此，有待开发对C反应蛋白(CRP)检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成本的检测技术。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的旨在提供一种C反应蛋白定量测定试剂盒，该试剂盒能够有效提高检测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种C反应蛋白定量测定试剂盒，其包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成。

另一方面，本发明还提供了这种C反应蛋白定量测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

分别配制C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物独立地置于包装容器内，得到C反应蛋白的定量测定试剂盒。

本试剂盒的异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体为能与人体内C反应蛋白抗原特异结合的单克隆抗体，所述碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体为能与C反应蛋白抗原特异结合的单克隆抗体。包被抗体和标记抗体除能与C反应蛋白抗原特异性结合外，配对使用时可与抗原形成“三明治”夹心结构。

具体地，所述C反应蛋白定量测定试剂盒按照如下方法制备而成：

A、C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品的配制方法如下：

用标准品缓冲液溶解C反应蛋白，配置C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品；其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；

B、抗试剂的制备方法如下：

1)抗试剂缓冲液的制备：

将12.12mg～60.57mg的Tris、0.01g～0.05g的四环素、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，制得抗试剂缓冲液；

2)异硫氰酸荧光素与C反应蛋白偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体：

首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，使用分光光度计在495nm处读取吸光值，来调整浓度，然后按照C反应蛋白抗体与异硫氰酸荧光素的质量之比为1:1.1，将二者同时转移到棕色玻璃瓶中，室温下搅拌1～2小时，充分反应后使用pH为8～9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体；紫外监测，记录仪记录纯化图谱，同时注意确认含有连接物的试管，注意、避光防护；

3)碱性磷酸酶与C反应蛋白抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体：