[发明专利]一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检疫的技术领域，具体涉及一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法。

背景技术

    牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV），又称牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVD-MDV)，属于黄病毒科(Flavivixidae)、瘟病毒属(Pestivirus)的成员。该病毒与猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）为同一个属。牛血清、冷冻胚胎、牛精液等牛源产品都可能污染BVDV，造成BVDV的传播。在兽用疫苗生产中，常使用牛血清、牛睾丸细胞、胰酶等牛源材料作为原材料。因此，一旦这些原材料中若有BVDV病原，会导致疫苗污染，尤其是猪用疫苗污染后，会导致免疫猪感染BVDV，造成自身类似猪瘟的临床症状给猪瘟的诊断带来困难外，还会成为BVDV的污染源。

    目前，为了预防BVDV的传播和流行，国内研究人员建立的检测方法主要有病毒分离、电镜观察、琼脂扩散法、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验、RT-PCR技术等。常规的检测方法费时费力，灵敏度低等缺点。常规的检测方法存在费时费力，灵敏度低等缺点。随着生物技术水平的发展，荧光定量RT-PCR方法的出现，为BVDV的检测提供了一种有力的工具。而荧光定量RT-PCR与普通RT-PCR相比具有灵敏性更强、特异性更好、污染几率小、自动化高、高通量等优势，因而成为一种越来越重要的检测技术。虽然BVDV的荧光定量RT-PCR方法具备上述优点，但是只能检测到BVDV的核酸，不能判断BVDV粒子是否具有感染性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，该方法能够快速、准确检测出BVDV粒子的活性，稳定检测出猪瘟活疫苗中污染的BVDV，应用于疫苗中牛源原材料污染BVDV的检测，为制备纯净的猪瘟弱毒活疫苗提供更有效的检测方法。

    本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，它包括以下步骤：

S1. MDBK细胞的培养

将长满单层的MDBK细胞，用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液以2～4×10⁵个/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，置于37℃ 5% CO₂的条件下培养，24h后细胞贴壁铺满孔底；其中，所述生长液为含有10%马血清的MEM培养基；

S2. BVDV的接种

用步骤S1培养的MDBK细胞接种BVDV，添加含2%的马血清至每孔200μl，培养72h，同时设不接种BVDV的MDBK细胞作为阴性对照；

S3. 间接免疫荧光检测牛病毒性腹泻病毒

    S31.洗涤： 将灭菌预冷的PBS洗去96孔板细胞残留的生长液，洗涤2～3次，每次4～6min；

    S32.丙酮固定：用丙酮固定30～60min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min；

    S33. 一抗孵育：用PBS稀释羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，湿盒37℃孵育45～90min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min；

    S34. 二抗孵育：再用PBS稀释兔抗羊IgG FITC二抗，湿盒37℃孵育45～90min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min；

    S35. 结果判定：将96孔板放在倒置显微镜上观察，判定结果。

    进一步地，步骤S1中所述长满单层MDBK细胞的培养方法为：MDBK细胞在细胞培养瓶中培养，生长液为含有10%马血清的MEM培养基，在 37℃ 5% CO₂的恒温培养箱中培养，2～3天传代一次，长满单层MDBK细胞。

    进一步地，步骤S32中所述丙酮温度为0～10℃，浓度为50%～80%。

    进一步地，步骤S33中所述羊抗牛BVDV多克隆血清一抗的稀释倍数为50～400倍。

进一步地，步骤S34中所述兔抗羊IgG FITC二抗的稀释倍数为为50～800倍。