[发明专利]一种家蚕核型多角体病毒快速检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

BmNPV LAMP预反应液，该反应液包括：1.2-1.6mM 引物BmNPV-FIP和BmNPV-BIP，0.2-0.4mM 引物BmNPV-F3和BmNPV-B3，0.05-0.1μM 探针BmNPV-FITC-PROBE，20-40mM Tris-HCl (pH8.0～9.0)，10-15mM 氯化钾，15 -20mM 硫酸铵，8-10mM 硫酸镁，0.1-0.2% Triton X-100，0.6-0.8M 甜菜碱，1.2-1.4mM dNTP，6-8U Bst DNA 聚合酶大片段；

其中，引物BmNPV-FIP序列见SEQ ID NO:1，引物BmNPV-BIP序列见SEQ ID NO:2，引物BmNPV-F3序列见SEQ ID NO:3，引物BmNPV-B3序列见SEQ ID NO:4, 探针BmNPV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO:5。

2.根据权利要求1所述的一种家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒， 其特征

在于，引物BmNPV-FIP为5’端生物素标记引物；探针BmNPV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。

3.根据权利要求1所述的一种家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒， 其特征

在于，所述试剂盒中还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品、阴性对照样品以及LAMP核酸反应管中添加有稳定液，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为家蚕核型多角体病毒基因组DNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water，核酸反应稳定液为液体石蜡油。

4.如权利要求1所述的一种家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒的应用，其特

征在于，所述试剂盒用于家蚕核型多角体病毒病的检测。

5.一种家蚕核型多角体病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用如权利要求

1所述的家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒进行检测，按照以下步骤进行：

A. 病毒DNA的提取：

（1）样品与裂解液TL混匀，匀浆后高速离心；

（2）取步骤（1）所离心后上清，向其中加入蛋白酶K溶液（20mg/mL），立刻振荡混匀，然后置于55℃水浴1～3小时直到组织消化完全；

（3）将消化液转移到带有玻璃纤维素膜的吸附柱AC中，吸附柱置于收集管中，离心；

（4）用漂洗液IR和去蛋白液WB洗涤上述吸附柱；

（5）利用灭菌过的双蒸水洗脱所述吸附柱上吸附的DNA；

B．BmNPV LAMP反应体系的扩增：

    在权利要求1所述试剂盒的BmNPV LAMP预反应液中加入5μL DNA模板，再加入适量的DEPC水或RNase free water使反应体系总体积为25μL，然后在61℃～65℃下反应45～60min；

    C. LFD试纸检测：

在扩增反应结束后，取5～10μL反应液滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50～100μL缓冲液，5～15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。

6.根据权利要求5所述的一种家蚕核型多角体病毒的检测方法，其特征在于，步骤B

中所述的反应温度为61℃，反应时间为45min。