[发明专利]产醛酮还原酶菌株、醛酮还原酶基因、载体、工程菌及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及醛酮还原酶产酶微生物、酶基因和构建这些基因的重组表达载体以及酶醛酮还原酶重组菌，并开发醛酮还原酶重组菌在阿托伐他汀手性侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成方面的应用。

(二)背景技术

心脑血管疾病已经成为危害人类健康的头号杀手，预计到2020年，心血管疾病死亡人数将占人类总死亡人数的36％。心脑血管疾病发病与人体内高胆固醇水平有密切关系。阿托伐他汀能竞争性抑制肝脏内胆固醇合成的关键限速酶—3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，降低内源性胆固醇的合成，是治疗高胆固醇血症和混合型高脂血症的有效药物，具有起效快、降脂能力强、作用时间长和毒副作用小等优点，是全球首个年销售额超过百亿美元的重磅炸弹药。

6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，是阿托伐他汀合成的重要手性中间体，也是关键的药效基团。由于各国药监部门对药物手性纯度设置严苛的限制(e.e.值>99.5％，d.e.值>99％)，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的合成技术成为阿托伐他汀合成的关键核心技术。传统的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成工艺从酮酸(酯)出发，通过不对称合成构建手性中心，反应路线复杂，需要使用易燃易爆的硼烷、正丁基锂等及深冷等特殊条件，导致产物d.e.值低、得率低、能耗大。而且，反应产生的硼化物废物处理困难，需要经过繁琐的反复甲醇淬灭、真空蒸馏处理。酶催化反应具有优异的选择性、反应条件温和等优点，一般在常温、常压及近中性条件下进行，把分解、异构化、外消旋化、重排等不利副反应降到最低限度，生物催化技术具备提高过程原子经济性、实现过程绿色环境友好 的基本条件。因此，开发生物不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯技术，具有巨大的经济效益和社会效益。

(三)发明内容

本发明目的是提供产立体选择性醛酮还原酶微生物乳酸克鲁维酵母(Kluyvzzzeromyces lactis)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)，3条来自K.lactis、Z.bailii的醛酮还原酶基因和含有上述基因的重组载体及其转化得到的重组菌，开发其在6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成方面的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种醛酮还原酶基因，所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5中的一种。其中SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示醛酮还原酶基因来自菌株--乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XP1461，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC NO:M 2014380，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。SEQ ID No.5所示醛酮还原酶基因来自菌株--拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)XP1462，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC M 2014381，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示的醛酮还原酶基因克隆自K.lactis XP1461(保藏编号CCTCC M 2014380)，SEQ ID No.5所示的醛酮还原酶基因克隆自Z.bailii XP1462(保藏编号CCTCC M 2014381)。所述的醛酮还原酶基因可以从K.lactis XP1461(CCTCC M 2014380)和Z.bailii XP1462(CCTCC M 2014381)基因组中分离获得， 也可以从该醛酮还原酶基因的重组载体中或者重组表达组中分离获得，也可以全人工合成获得。