[发明专利]ELISA方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体浓度

说明书

技术领域

本发明涉及定量测定血清中单克隆抗体药物浓度的方法。本发明的方法采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法对血清中抗CD20单克隆抗体浓度进行分析，具有良好的灵敏度和特异性等优点。

背景技术

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是最常见的淋巴组织恶性肿瘤，其死亡率在我国居恶性肿瘤中的第十位。NHL的传统治疗方案是以化疗为主，局部放疗、手术治疗为辅的综合治疗。迄今为止，传统细胞毒化疗药物进一步提高恶性淋巴瘤临床疗效的空间十分有限，单克隆抗体已经成为对经过选择的NHL患者较为成功的一种治疗方法。治疗B细胞性NHL最常用的抗体靶目标包括CD20、CD22等。

CD20抗原位于前B和成熟B淋巴细胞的表面，而造血干细胞、正常浆细胞或其它正常组织不表达CD20。95％以上的B细胞型非霍奇金淋巴瘤瘤细胞表达CD20。重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体与B细胞表面的CD20抗原特异性结合后，启动介导B细胞溶解的免疫反应，作用机制包括补体依赖的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)、生长抑制作用等^[1-2]。因此，CD20抗原是靶向治疗非霍奇金淋巴瘤的有效靶点。国外同类品种利妥昔单抗注射液(英文名称：Rituximab Injection；商品名称：利妥昔单抗(商品名：美罗华))由IDEC/Genentech公司开发，于1997年11月获美国FDA批准用于NHL治疗，1998年欧盟也批准该药上市。利妥昔单抗注射液于2000年3月在我国获得进口许可。利妥昔单抗注射液上市规格为500mg/50ml、100mg/10ml，临床治疗NHL使用推荐剂量为375mg/m²BSA(体表面积)。

神州细胞工程有限公司研制的重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体SCT400是一种人鼠嵌合IgG1型抗CD20单克隆抗体，能特异性地与跨膜抗原CD20结合，临床上拟单用或与化药联合治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)。SCT400抗原结合位点和抗体可变区氨基酸序列与利妥昔单抗完全相同，恒定区与利妥昔单抗在重链CH1区域仅有一个氨基酸差异(V219A)已经开展了针对SCT400和利妥昔单抗在质量、临床前药效、安全性评价等方面的比较研究工作。研究结果证明二者的理化特性、生物活性、体内外药效和药代动力学特征基本一致；临床前安全性评价结果也证实二者具有高度相似和可比性。基于以上临床前数据和临床研究，在中国医学科学院肿瘤医院和307医院展开了多中心、开放I期临床药代动力学试验。

目前目前已经由多篇文献报道应用ELISA的方法检测人血清中利妥昔单抗的浓度[Maloney et al，1994；Berinstein et al，1998；Tobinai et al，1998；Iacona et al，2000，Buem et al，2004；Cragg et al，2004；Hampson et al，2010]。但文献报道的多克隆抗体，如纯化的多克隆羊抗IDEC C2B8抗体血清、羊抗人IgG结合辣根过氧化氢酶、商品化的兔抗鼠IgG或者是过氧化氢酶标记的羊抗鼠IgG被用于一系列利妥昔单抗的临床研究中，但是在这些临床研究中样本检测前需要稀释1/20000倍以上因为缺少特异性，且与正常人IgG有交叉反应。因为这个原因，Cragg提出了使用特异的mAb MB2A4直接检测利妥昔单抗的浓度，这种分析方法呈现出高的特异性，但是需要进行高通量筛选、费用昂贵因此很难被广泛运用。并且这种抗独特性抗体只能检测游离的利妥昔单抗的浓度不能检测循环的CD20-利妥昔单抗的混合浓度。

参考文献

Anderson KC，Bates MP，Slaughenhoupt BL，Pinkus GS，Schlossman SF，Nadler LM.1984.Expression of human B cell associated antigens on leukemias and lymphomas：A model of human B cell differentiation.Blood；63：1424-33.

Berinstein，N.L.，Grillo-Lopez，A.J.，White，C.A.，Bence-Bruckler，I.，Maloney，D.，Czuczman，M.，Green，D.，Rosenberg，J.，McLaughlin，P.，Shen，D.，1998.