[发明专利]人铁蛋白轻链重组毕赤酵母的构建及高密度发酵生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及高水平分泌表达人铁蛋白轻链的重组毕赤酵母的构建方法及利用该重组毕赤酵母高密度发酵生产人铁蛋白轻链的方法。

背景技术

铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)是铁蛋白的一种亚基。铁蛋白(ferritin)是一种普遍存在于生物体内的保守性较高的多功能多亚基生物蛋白，是细胞内主要的铁储存蛋白。在体内，铁蛋白的主要生理功能是储存机体中的过剩铁，避免产生铁中毒和释放铁给需铁的细胞，用于体内生物合成含铁的蛋白质或酶。因此它可以避免过量铁通过Fenton反应产生活性氧(ROS)，从而起到保护机体免受氧化损伤的作用。目前，DNA的氧化损伤与肿瘤之间的关系已较明确，因此，铁蛋白与肿瘤之间关系的研究也备受人们关注。铁蛋白含有2种不同的亚基，分别为肝脏型(L型)和心脏型(H型)，也称为轻链L(～19500)和重链H(～21000)。铁蛋白H亚基与肿瘤之间关系的研究已有很多，二者关系已较确定，而与之具有55％序列同源性的铁蛋白L基是否具有类似作用，此问题也开始引起一些研究人员的重视。目前，在肝癌、胃癌等肿瘤的研究中都发现有铁蛋白L亚基的异样表达。由于铁蛋白与炎症病变、血液病、肝病、心脑血管疾病、肾病以及恶性肿瘤等密切相关，在这些疾病的临床诊断、治疗、监测中都起到重要的作用。因此，有必要开发一种铁高质量的铁蛋白检测试剂盒，因此就需要开发高质量的校准与质控以及抗原抗体原材料。

目前，在试剂盒开发的过程中多以组织纯化的铁蛋白作为校准、质控或抗体的制备原料，但是组织纯化的铁蛋白其活性、线性、稳定性、特异性、敏感性以及保存时间等都有可能受到来源不同而差异巨大，因此需要开发利用基因工程手段制备的高特异性重组蛋白。

在专利申请文件《一种基因重组人铁蛋白轻链的制备方法》(专利申请号：CN200910141974.0)中曾经提到用大肠杆菌重组表达人铁蛋白轻链。在多种表达系统中，大肠杆菌表达系统是目前研究最为深入，发展最迅速的原核表达系统。作为生命科学研究的模式生物之一，大肠杆菌不仅在遗传学背景，基因表达调控机理方面的研究已经非常清晰，而且拥有多种适应不同表达的载体和宿主菌，但是作为原核生物，大肠杆菌的外源表达依旧具有以下缺点：(1)大肠杆菌系统不具有真核细胞翻译后修饰加工的功能，无法帮助真核蛋白糖基化，磷酸化，正确折叠和分泌等；(2)大肠杆菌无转录后剪切过程，无法识别真核基因内含子区域。因此对于需要进行糖基化修饰或其他翻译后修饰的真核生物的蛋白，用大肠杆菌表达系统还是会存在一定的缺陷。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题而提供一种毕赤酵母高密度发酵生产人铁蛋白轻链的方法，更具体的是提供一种高水平分泌表达人铁蛋白轻链的重组毕赤酵母的构建方法及利用该重组毕赤酵母高密度发酵生产人铁蛋白轻链的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

人铁蛋白轻链重组毕赤酵母的构建，具体如下：

1)人铁蛋白轻链基因编码序列的合成：根据人铁蛋白轻链基因编码序列，合成人铁蛋白轻链基因，并在两侧引入酶切位点，回收片段并连接到pet23a载体，得到质粒pet23a/ferritin L，经测序为正确序列；

2)真核表达载体的构建：将质粒pet23a/ferritin L和载体Ppic9k经过双酶切后回收，再进行连接，连接完成后转入XL-GOLD菌株，找到重组子，得到质粒Ppic9k/ferritin L；

3)转化真核宿主毕赤酵母：用Sac Ⅰ单酶切质粒Ppic9k/ferritin L线性化后溶液回收，转化到毕赤酵母GS115中，然后筛选重组毕赤酵母，再通过菌落PCR的方法来验证。

进一步地，所述质粒pet23a/ferritin L和载体Ppic9k在Solution Ⅰ溶液中进行连接，连接温度为12-20℃，连接时间为2-4小时。

利用上述的重组毕赤酵母高密度发酵生产人铁蛋白轻链的方法：

接种所述的重组毕赤酵母于YPD液体培养基中培养至OD600在4-6之间时，将上述培养液接种到发酵罐培养基BSM中发酵，发酵过程分为两个阶段：

第一阶段，发酵参数为：温度26-28℃，pH值5.0-6.0，搅拌速度300-700rpm，溶氧量40％以上；待发酵罐中的甘油被消耗尽时，流加PTM1的甘油溶液，当菌体密度OD600等于300时停止，进入第二阶段；