[发明专利]DNA微阵列芯片检测与Ⅱ型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方法

权利要求书

1.一种DNA微阵列芯片检测与Ⅱ型糖尿病相关的单核苷酸多态性的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物；

具体步骤如下：将6条100μM巯基修饰的寡核苷酸以SP₁:SP₂:SP₃:SP₄:SP₅:SP₆＝1.2:1.2:0.6:1:1.6:1.6的比例混合；取5μl该寡核苷酸混合溶液与300μl 8nM的金纳米粒子混合均匀，室温静置反应10h，再加入等体积的PBS缓冲溶液，混合均匀后反应过夜；将反应后的溶液真空离心浓缩至100μl，通过离心提纯反应产物，获得6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物；

其中所述寡核苷酸序列分别为：

SP₁：(T₁₀)CTCTCTTACATA，SP₂：(T₁₀)ATTTAAACCTTC，

SP₃：(T₁₀)TTCCTGGTTTCA，SP₄：(T₁₀)ACTTGATGCAAT，

SP₅：(T₁₀)ATAGACTTACTG，SP₆：(T₁₀)GGCAATTAAATT；

(2)筛选出用于Ⅱ型糖尿病6个突变位点检测的6条特定寡核苷酸探针；

所述的6个突变位点分别为：rs11196205，rs11196218，rs6585205，rs10946398，rs10811661，rs7903146；

所述的6条特定寡核苷酸探针序列分别为：

P₁：CTGCTCGTAGTTATAA(T₁₀)-NH₂，

P_1A：CTGCTGGTAGTTATAA(T₁₀)-NH₂，

P₂：TCGGGTGCTTATGAAA(T₁₀)-NH₂，

P_2A：TCGGGTGTTTATGAAA(T₁₀)-NH₂，

P₃：TCTAAGTCGTGGGGCA(T₁₀)-NH₂，

P_3A：TCTAAGTAGTGGGGCA(T₁₀)-NH₂，

P₄：GACAGCATAACGATAC(T₁₀)-NH₂，

P_4A：GACAGCAGAACGATAC(T₁₀)-NH₂，

P₅：TCATGAGAAAACTAAA(T₁₀)-NH₂，

P_5A：TCATGGGAAAACTAAA(T₁₀)-NH₂，

P₆：ATATAGTATCTAAAAA(T₁₀)-NH₂，

P_6A：ATATAATATCTAAAAA(T₁₀)-NH₂；

(3)利用标准制作方法将特定寡核苷酸探针点样液点样到芯片上制备得到DNA微阵列芯片；

(4)用所述的DNA微阵列芯片对模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标和Ⅱ型糖尿病实际样品进行检测，再用6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物对检测结果进行标记；

所述6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的平均粒径为13nm；

所述特定寡核苷酸探针点样液的点样浓度为30μM；

步骤(4)中所述的模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标的浓度为500nM，所述的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的浓度为3nM；

步骤(4)中用所述的DNA微阵列芯片对模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标和Ⅱ型糖尿病实际样品进行检测、及再用6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物对检测结果进行标记的反应温度均为30℃；

步骤(4)中所述的模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标序列分别为：

T₁：TTATAACTACGAGCAGTATGTAAGAGAG,

T_1A:TTATAACTACCAGCAGTATGTAAGAGAG，

T₂：TTTCATAAGCACCCGAGAAGGTTTAAAT，

T_2A:TTTCATAAACACCCGAGAAGGTTTAAAT，

T₃：TGCCCCACGACTTAGATGAAACCAGGAA，

T_3A：TGCCCCACTACTTAGATGAAACCAGGAA，

T₄：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT，

T_4A：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT，

T₅：TTTAGTTTTCCCATGACAGTAAGTCTAT，

T_5A：TTTAGTTTTCTCATGACAGTAAGTCTAT，

T₆：TTTTTAGATACTATATAATTTAATTGCC，

T_6A：TTTTTAGATATTATATAATTTAATTGCC；

步骤(4)中所述：

用所述的DNA微阵列芯片对模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标进行检测时，所述模拟Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶标T₁、T₂、T₃、T₄、T₅、T₆、T_1A、T_2A、T_3A、T_4A、T_5A和T_6A的浓度分别为：0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500和1000nM，寡核苷酸探针P₁、P₂、P₃、P₄、P₅、P₆、P_1A、P_2A、P_3A、P_4A、P_5A和P_6A的点样浓度均为30μM；

用所述DNA微阵列芯片对Ⅱ型糖尿病实际样品进行检测时，实际样品的浓度分别为：0.5、1、5和10nM，寡核苷酸探针P₁、P₂、P₃、P₄、P₅、P₆、P_1A、P_2A、P_3A、P_4A、P_5A和P_6A的点样浓度均为30μM；

在步骤(4)之后还包括如下步骤：

将所述DNA微阵列芯片与1mL银增强溶液反应8min；

所述银增强溶液为硝酸银溶液与氢醌溶液的混合溶液，硝酸银溶液与氢醌溶液的体积比为1:1。