[发明专利]一种用于快速提取DNA的磁性纳米粒子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于快速提取DNA的磁性纳米粒子的制备方法。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，当代生物学、医学等已深入到分子水平，对所利用的进行高效分离、富集、提取、转载的DNA生物大分子的需求也日益提高。然而目前常用的DNA提取纯化方法都因存在自身缺陷而无法满足人们进行深入实验的要求。酚/氯仿抽提法曾经是分子生物学中经典的提取DNA方法，但由于酚/氯仿对人体的巨大毒害作用和对环境的强烈污染，在提倡绿色环保的今天将会大大局限其的应用范围。时市场上的DNA抽提试剂盒由于操作步骤比较复杂、原料需要预处理、且原料自身理化性能不强造成产率不高等而无法满足人们的要求。

四氧化三铁磁性纳米粒子毒性低，具有磁响应性，当粒径足够小时，具有超顺磁性，即在外加磁场中有较强的磁性，撤离磁场时，磁性很快消失，剩磁为零，不会被永久磁化。

经PAA包覆的四氧化三铁磁性纳米粒子，可以使其既具有磁性和水溶性，又具有表面活性基团，能进一步和细胞、酶、蛋白质、抗体及核酸等多种生物分子偶联。在外加磁场的作用下，磁性纳米粒子能够很方便地和底液分离，具有操作简便和分离效率高的优点。此外，PAA四氧化三铁磁性纳米粒子具有大的比表面积，为修饰多种高密度分子探针提供了基础，在细胞分离、蛋白质纯化及DNA分离检测等领域显示出广阔的应用前景。

总的来说，磁性纳米粒子的制备方法可以分为物理法、生物法和化学法。其中物理法以机械球磨法为主要代表，球磨法是将微米或亚微米的粒子进行长时间研磨，然后分散到油基介质中而得，这种制备方法得到的粒子的粒径分布比较宽，同时这种制备方法所消耗的时间也比较长。磁性纳米粒子的生物制备法主要是指磁性纳米粒子广泛地存在于各种生物体如细菌，鸽子等体内，利用生物法制备的粒子粒径比较均一且形貌规则，缺点在于细菌培养较为困难，粒子提取的过程也较为繁琐。所以目前来说，对于研究磁性纳米粒子的合成主要还限于化学法制备的磁性纳米粒子，磁性纳米材料的化学合成法又可以分为均相制备法和非均相制备法，其中均相制备法包括共沉淀法和高温分解法，非均相制备方法有微乳液法、溶胶-凝胶法、超声化学法、激光分解法和电化学沉积法等。

本发明采用高温分解法研制粒径均一、磁响应性强的生物相容性PAA四氧化三铁磁性纳米粒子，应用于细胞DNA的提取纯化。

传统的DNA分离纯化方法不仅需接触多种有机溶剂和有毒试剂，而且步骤繁杂难以控制。PAA四氧化三铁磁性纳米粒子可以通过其表面羧基与DNA分子结合，再用缓冲液洗脱即可得到纯化率较高的DNA分子。

发明内容

本发明的目的在于提出一种用于快速提取DNA的磁性纳米粒子的制备方法。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于快速提取DNA的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)、制备纳米四氧化三铁胶体，将二氯化铁和三三氯化铁按2:1的摩尔比溶于水中，搅拌条件下缓慢滴加浓度为1％-10％的氨水至有絮状黑色沉淀出现，直到PH为10～12，静置24-48小时，过滤，用去离子水洗涤至PH＝7，将所得沉淀烘干待用；

(2)、将PAA溶于二甘醇DEG中，配置成0.1-10M浓度的溶液，在该溶液中加入步骤(1)获得的沉淀，搅拌的混合溶液，所述沉淀的加入量以混合溶液的重量基准为1-10％；混合溶液在氮气保护下油浴220℃加热回流2h后，继续220℃加热回流反应2h，得到黑色粘稠的胶体液，终止反应，静置冷却，得反应液；

(3)、将步骤(2)获得的反应液置于离心管中，加入5倍反应液体积的无水乙醇，8000rpm离心5min，重复洗涤3次，沉淀用去离子水洗涤2次，分散于反应液相等体积的去离子水中；

(4)用0.22μm膜过滤，制得聚丙烯酸包覆四氧化三铁磁性纳米粒子。

制备得到的PAA包覆四氧化三铁磁性纳米粒子的应用，用于细胞DNA的分离纯化，步骤如下：

(1)裂解组织或细胞：称取适量组织或细胞，加入适量抽提裂解液于冰上快速磨碎成组织液或细胞液后裂解3-5小时；

(2)离心后的细胞加5μL细胞裂解液(3M NaCl、5M尿素Urea、40g/LTritonX-100、10mM乙二胺四乙酸EDTA、pH6.5的25mM Tris-HCl)混匀，加25μg/μL的蛋白酶K 10μL及40μg/μL的RNA酶5μL，37℃孵育30min，加入18mg/mL的PAA包覆四氧化三铁磁性纳米粒子10μL，静置2min；