[发明专利]一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法

说明书

技术领域

本发明涉及油棕种胚样品的制备，具体涉及一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法。

背景技术

油棕是重要的热带产油植物，目前主要通过种子进行种苗繁育，但存在种子萌发周期长且萌芽率低等问题。解除高度木质化的种子外壳及外围致密胚乳等物理限制，然后通过胚培养开展种苗繁育或种子萌发相关研究是一条重要途径，而获得完整的无菌种胚是前提。油棕胚呈长圆锥状，长度约2-3mm，质地柔脆，被包裹在坚硬的致密胚乳中，外围依次是高度木质化的种子外壳以及富含油脂的果肉。现有技术通常需要带胚乳灭菌，然后在超净工作台中剥胚，取胚效率低且胚的完整性差，而种胚的千粒重仅为1.2g左右，远远无法满足相关实验对每批次需制备大量种胚样品的需求。

取胚效率是制备大量种胚样品的技术瓶颈。鉴于油棕种胚细小柔脆，目前只能通过手工剥胚。含种胚的油棕胚乳仅为小型花生粒大小，近圆形且致密坚硬。带胚乳剥胚时，受力点不易掌握，尤其是在操作空间受限的超净工作台中，极易因手工取胚过程中的机械损伤导致后续污染或无法正常萌发，并因此严重拖慢取胚速度及接种速度。而用剪枝剪直接从油棕果实中取出裸胚具有受力面积大、可操作性强、取胚速度快、胚完整性好等优点。此外，直接进行裸胚消毒具有消毒试剂浓度低、消毒时间短、环境污染小等优点，是制备大量油棕种胚样品的理想方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法，该方法在短时间内即可获得大量无菌油棕种胚样品，能够满足组织培养以及基于胚培养的转录组、蛋白质组等相关研究对大量样品的需求。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法，包括如下步骤：

(1)收集成熟的油棕果实，用剪枝剪沿果柄中心线剪开三分之二，掰开即可看到乳白色的种胚，然后用解剖针将种胚挑出。

(2)用镊子挑选保留外观健壮饱满的种胚。

(3)用0.01-0.05％的氯化汞冲洗种胚后再在超净工作台中用0.01-0.05％的氯化汞浸泡消毒5-30min。

(4)将(3)中获得的种胚用灭菌水漂洗除去残留的氯化汞，再用灭菌滤纸除去灭菌水，接种至MS基本培养基中于20-30℃条件下暗培养2-5天，再转移至光培养条件下培养15-25天即可萌发；所述的MS基本培养基为PhytoTechnology公司的含维生素的MS基本培养基。

步骤(4)中所述的光培养条件优选为：光照强度为1500-3500LX、温度为25-35℃。

优选的，所述的批量制备无菌油棕种胚样品的方法包括如下步骤：

(1)收集成熟的油棕果实，用剪枝剪沿果柄中心线剪开三分之二，掰开即可看到乳白色的种胚，然后用解剖针将种胚挑出，转移至固定在烧杯口的聚酯纤维纱布上。

(2)根据肉眼观察比较，用镊子挑选保留外观健壮饱满的种胚。

(3)用装有0.01-0.05％氯化汞的喷壶在纱布上喷雾冲洗种胚，然后用药勺将种胚转移至超净工作台中的灭菌烧杯中，用0.01-0.05％的氯化汞浸泡消毒5-30min。

(4)将(3)中获得的种胚用灭菌水漂洗3-5次除去残留的氯化汞，转移至垫有灭菌滤纸的灭菌培养皿中除去灭菌水，然后接种至装有PhytoTechnology公司的含维生素的MS基本培养基培养皿中；接种好的培养皿先在20-30℃条件下暗培养2-5天，再转移至光培养条件下培养15-25天即可萌发。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

(1)用剪枝剪和解剖针直接取胚，可操作性强、取胚速度快，人工取胚效率可达100个/小时，且胚完整性好。

(2)由于油棕果穗发育状态及果粒着生位置的不同，种胚的发育状态及饱满程度也有所不同，而发育不良的胚容易寄生各种真菌和细菌，且不易萌发或后期生长不良。本发明提前剔除了发育不良的种胚，降低了种胚污染率，同时提高了后续萌发率。

(3)油棕种胚质地柔嫩，对酒精、次氯酸钠、氯化汞等常用消毒剂的耐受性差，如消毒处理不当，极易因消毒剂量过大导致无法萌发，而消毒剂量不足又会造成大量污染。本发明用0.01-0.05％的氯化汞消毒5-30min，消毒浓度低、时间短，环境污染小，可将种胚的整体污染率控制在5％以内，且不影响萌发，大大降低了后续胚培养的工作量。