[发明专利]利用乙酸生产丁二酸的代谢工程大肠杆菌菌株构建方法和应用

说明书

本发明公开一种利用乙酸生产丁二酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法和应用，代谢工程改造的大肠杆菌使用乙酸为原料发酵生产丁二酸，其改造途径为阻断TCA循环，并和/或阻断丁二酸利用途径，并和/或增强乙酸摄取和草酰乙酸供给，强化乙醛酸循环，和/或缺失副产物生成途径，和/或减少从丙酮酸脱羧生产乙酸引起的无效循环，和/或疏导乙酰CoA节点代谢流。本发明通过对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得的菌株在以乙酸为碳源的培养基中，能够产生丁二酸，且没有副产物产生。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地讲，涉及构建利用乙酸生产丁二酸的重组大肠杆菌菌株，以及通过乙酸为主要原料利用该代谢工程大肠杆菌发酵合成丁二酸。

背景技术

丁二酸，又名琥珀酸，是一种四碳二羧酸，广泛应用于农业、食品及医药行业。丁二酸是许多重要工业化学品的前体，包括已二酸，1,4-丁二醇，四氢呋喃，N-甲基吡咯烷酮，2-吡咯烷酮，丁二酸盐及γ-丁内酯。还可用于合成可生物降解的聚合物聚丁二酸丁二醇酯(PBS)及聚酰胺聚合物(x,4)。目前，商业用丁二酸已经由液化石油气或矿物油经化学合成生产，转变为生物发酵生产(Catal.Today(2014),http://dx.doi.org/10.1016/j.cattod.2014.05.035)，利用可再生资源通过生物发酵法生产丁二酸比石油炼制更具经济和社会效益，因此受到广泛关注(Enzyme and microbial technology,2006,39(3):352-361)。

丁二酸生产菌株主要为产丁二酸厌氧螺菌Anaerobiospirillumsucciniciproducens，产丁二酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes，曼海姆产丁二酸菌Mannheimia succiniciproducens，重组大肠杆菌Escherichia coli，酿酒酵母Saccharomyce scerevisiae(Metab Eng,2010,12(6):518-525)，谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum(PLoS One,2013,8(4):e60659)等。其中大肠杆菌由于基因遗传背景清楚，基因操作简单，同时发酵底物多为可再生资源，如葡萄糖，木糖，甘油，麦草、玉米秸秆等木质纤维素，木薯、菊芋等淀粉类物质，而更具有工业价值。

利用重组大肠杆菌发酵丁二酸的生产，大量工作针对葡萄糖的代谢途径改造，包括在好氧和厌氧条件下葡萄糖到丁二酸的代谢流引导。San等(Biotechnol Bioeng,2005,90(6):775-779)构建的大肠杆菌HL27658k(pKK313)，阻断TCA循环，切除副产物形成途径，解除乙醛酸支路阻遏，实现葡萄糖好氧转化积累丁二酸58.3g/L，得率为0.94±0.07mol/mol葡萄糖，生产强度为1.08±0.06g/(L.h)。Zhao等(Journal of IndustrialMicrobiology&Biotechnology,2013,40(12):1461-1475) 构建的大肠杆菌E2-Δsdh-ppc-sucAB，阻断TCA循环和过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、琥珀酰辅酶A合成酶的改造下，在甘油基本盐培养基中，丁二酸的最大体积生产速率和平均体积生产速率分别为19.2和6.55mM h^-1。

乙酸主要由甲醇的羰基化制备，即甲醇和一氧化碳制备，是一种大量而廉价的碳源，同时也是木质纤维素材料酸水解中形成的主要副产物之一。乙酸是许多微生物厌氧代谢的终产物和有氧代谢的不完全氧化产物，大肠杆菌可以好氧代谢乙酸进行生长，并且以乙酸为唯一碳源好氧生长时，乙醛酸支路和糖异生途径的关键酶活性会得到显著提高，有利于随后进行葡萄糖到丁二酸的厌氧转化(Applied and Environmental Microbiology,2007,73(24):7837-7843.)。但是目前为止尚未有采用乙酸作为碳源直接生物合成丁二酸的研究报道。本发明从增强底物摄取、阻断下游分解代谢和疏导代谢流等多方面对大肠杆菌进行改造，使其能够直接利用乙酸为碳源生产丁二酸。

发明内容