[发明专利]一株高产纤维素酶的里氏木霉及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一种高产纤维素酶的里氏木霉及其在纤维素酶生产中的应用。

背景技术

里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种丝状真菌，属于多细胞的真核微生物，是红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型，分类上隶属于真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、木霉属。里氏木霉广泛分布于自然界，在腐木、种籽、植物残体、有机肥、土壤和甚至是空气中(Montenecourt&Eveleigh,1979,Adv Chem Ser.)。

里氏木霉能表达多种胞外纤维素酶和半纤维素酶，包括外切纤维素酶(CBH1和CBH2)、内切纤维素酶(EG1、EG2、EG3、EG4和EG5等)、beta-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等。通过这些纤维素酶和半纤维素酶的协同作用，将纤维素彻底分解为单糖(Biely&Tenkanen.1998,In Trichoderma and Gliocladium)，因此，木霉产纤维素酶已经是二代纤维素生物乙醇的主要酶制剂来源。

但是，木霉纤维素酶和半纤维素酶往往是协同表达的，而影响木霉纤维素酶表达的因素很多。首先，培养碳源的影响：纤维素，乳糖和槐糖用来诱导木霉产纤维素酶；葡萄糖和甘油等阻遏纤维素酶的表达。碳源的诱导作用是调控因子来影响表达的，如与诱导表达相关的正调控因子是ACEII和XYR1，而负调控因子是CRE1和ACEI(Ilme′n et al.,1997,Mol.Gen.Genet.；Foreman et al.,2003,J.Biol.Chem.)。其次，菌体(菌丝)形态也是影响分泌表达的关键因素之一。一般认为，丝状真菌是通过顶端分泌来输出胞外蛋白的。因此，高效分泌菌株形态上往往是多分枝的。

然而从自然界中直接筛选到的木霉菌株产酶水平往往很低，不适合商业生产。因此，如何通过现有技术改造木霉菌株提高其胞外蛋白含量，以降低生产成本就成为本领域的研究热点之一。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产纤维素酶的里氏木霉菌株及其应用，通过紫外诱变的方法获得了一株菌落形态小且高产纤维素酶的里氏木霉突变株，可广泛应用于纤维素酶的生产，降低生产成本。

本发明一方面提供了一株里氏木霉(Trichoderma reesei)突变菌株VLKDN-1，已于2014年10月22日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2014506。

本发明还提供了上述里氏木霉突变菌株VLKDN-1在纤维素酶生产中的应用。

本发明利用紫外诱变技术，并结合摇瓶筛选获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突变菌株。与出发菌相比，突变菌里氏木霉VLKDN-1的发酵上清液酶活提高了235％，蛋白含量提高了157％；该突变菌的菌落形态明显小于出发菌，且菌丝比出发菌的菌丝短、分枝多。在生产过程中，该突变菌株“小型化”的菌落形态以及菌丝短、分枝多的特点能使发酵菌液的粘度显著降低，达到降低搅拌速度又提高溶氧的目的，从而有利于降低生产成本，应用前景广泛。

附图说明

图1：出发菌和突变菌的菌落形态比较，其中：A为出发菌，B为突变菌里氏木霉VLKDN-1；

图2：出发菌和突变菌的菌丝形态比较，其中：A为出发菌，B为突变菌里氏木霉VLKDN-1。

具体实施方式

下面结合具体的实施方案对本发明进行更详细的描述。但本发明并不受所述实施例的限制。提供实施方案的目的是为了使说明书全面而透彻，并向本领域的技术人员全面传达发明的范围。除另定义外，本发明所使用的所有技术和科学术语均具有作为本发明所属技术领域中普通技术人员通常理解的同样的含义。

实施例1菌落“小型化”突变菌株的筛选

1、菌种处理：

将出发菌种里氏木霉(该菌株是本专利发明人黄亦钧于2013年6月从青岛市崂山区林场的枯树皮中筛选到的)接种于PDA琼脂平板(马铃薯200-300克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，自来水1000毫升，自然pH)上，28-30℃恒温培养1周至稳定期。待孢子成熟后，往平板上加入5-10ml无菌水洗刷孢子，吸取孢子悬液并计数，依据孢子含量用调整其浓度至10^5-6个/ml，然后进行后续诱变处理。

2、诱变筛选：