[发明专利]偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备方法，具体涉及一种偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法。

背景技术

肌钙蛋白是一种调节心肌收缩的蛋白质分子，由肌钙蛋白C（TnC）、肌钙蛋白T（TnT）和肌钙蛋白I（TnI）三个亚基组成。随着心脏生物标志物应用的不断发展，肌钙蛋白已成为诊断心肌梗死（MI）的首选标志物。该标志物的临床快检（POCT）的发展，能够让患者得到及时适当的治疗。以罗氏的肌钙蛋白T测试卡为例，cTnT的临界值为0.1ng/ml，检测卡的检测范围为0.1-2ng/ml，检测时间为8-12分钟。

目前用于POCT诊断cTnT和cTnI的免疫学方法主要包括了胶体金免疫层析法和荧光法。这两种方法都能够应用于诊断试纸条。

胶体金免疫层析法制备的胶体金诊断试纸条，其检测结果可通过肉眼观察到显色现象。但肌钙蛋白的浓度无法通过颜色变化准确定量。此外，金纳米与抗体的连接通常采用被动吸附法，该反应虽然简单快速，但无法控制抗体的Fab端在纳米颗粒表面的方向性，降低了抗原捕获效率，对抗体原料的利用率也有一定的影响。

荧光法与胶体金免疫层析法类似，相对于金纳米颗粒而言，荧光微球在诊断试纸条上流动时，由于微球尺寸较大（200nm及以上），容易产生团聚；流动过程中，微球-抗体连接物在未到达T线时已经发生了部分的沉积，造成较强的非特异性吸附；在检测时，由于光学检测器只能收集试纸条表面的光强信号，对血样全部流过T线后的情况无法完全反映，使得检测结果不精准。

半导体量子点虽然光稳定性好、发射谱带较窄、量子产率较高、发光可调，但其潜在的生物毒性及间歇发光性（光闪烁）限制了在生物检测领域的应用。

稀土上转换发光材料的晶体高晶化程度对材料的发光能力影响显著。但提高高晶化程度会大大增加合成材料的工序和成本。配套的光学检测器对激发光的波长范围要求很高，而常规激发光的发射功率又偏低，导致了包括发光材料和检测器在内的整套检测产品的制造成本偏高，限制了该类材料的大规模生产与普及应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种改进的、偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法。本方法中提供了新的磁珠包被方法：特别是包括活化步骤与偶联步骤：以2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液（MES buffer）作为活化缓冲液，对表面有羧基的磁珠进行活化；以硼酸-吐温作为缓冲液（BST buffer），将活化后的磁珠与单克隆抗体16A11/810进行偶联。本发明的制备方法操作简单，结果可靠。新方法所制备的诊断试纸条克服了现有技术的不足，能够简单快速地检测肌钙蛋白，检测结果更加精准，应用领域较宽，对抗体原料的利用率较高。

本发明的方法所制备的偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条，与现有技术有所区别，该诊断试纸条的结构是，在结合垫与吸收垫之间设有NC膜（硝酸纤维膜），该NC膜为滴入待检测的血样的区域，其特征在于，在所述的NC膜中，含有免疫磁珠；该免疫磁珠是指：直径约200nm的由聚苯乙烯包裹的铁纳米颗粒，表面有羧基，并在活化缓冲液中与单克隆抗体偶联后构成的偶联了抗体的免疫磁珠。

偶联了抗体的免疫磁珠，可以简称为“磁抗”， 其中，所述被偶联的抗体，可以是16A11和/或810。根据偶联抗体的不同，可以分别称为：16A11磁抗或810磁抗。

完成本申请发明任务的技术方案是，一种偶联免疫磁珠的肌钙蛋白诊断试纸条的制备方法，其特征在于，步骤如下：

步骤⑴-步骤⑺为试纸条制作：

⑴.试纸条在32℃过夜干燥；

⑵.将NC膜从冰箱取出，剪取适当长度置室温平衡至少2h；

⑶.配所需浓度的抗体，2mg/ml的19C7； 方法：19C7抗体用buffer稀释；

⑷.将NC膜贴到底板上；

⑸.划线之前先用稀NaOH清洗一个循环后静置，再用稀HCl清洗一个循环，静置后用纯水清洗一个循环；划线机配置：1.5μl/cm，用铅笔将划好的T线标记好；

⑹. 32~37℃干燥过夜；

⑺.干燥结束，贴样品垫、吸水垫、AR膜，随后切条装盒备用；

步骤⑻-步骤⑼.为磁珠包被方法：

⑻.活化：