[发明专利]来源于瓜类炭疽病菌的漆酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属微生物技术领域，具体涉及一种优化后适用于毕赤酵母表达的漆酶ClLACI序列及其应用。

背景技术

近年来，随着基因测序技术的飞速发展，大量的基因信息被公布。在NCBI数据库中，许多编码蛋白的序列通过生物信息学分析，都已被分类注释。但大多数蛋白的生理生化功能都是未知的。因此，研究这些蛋白的功能，开发期应用潜力，具有重要意义。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，属于多铜氧化酶家族。它能催化多种底物，包括：酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、生物色素与甾体激素、金属有机化合物等。在介体存在的条件下，漆酶的底物范围还能进一步扩大。可应用于造纸、纺织、生物合成、废水处理等诸多领域。瓜类炭疽菌（Colletotrichum lagenarium）是一种能够引起瓜类产生炭疽病的致病菌。本发明所述的漆酶基因既是来源于这种微生物，直接从其中分离并纯化目的漆酶，难度大、耗时长、成本高。而毕赤酵母表达系统可以分泌表达外源蛋白，易于纯化，且发酵方法成熟、操作简单，是生产漆酶的理想方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种优化后适用于毕赤酵母表达的漆酶ClLACI序列及其应用。基于野生型基因序列，删除组成N端信号肽的23个氨基酸的基因序列。按毕赤酵母偏爱密码子，避免基因中出现 ATTTA等PolyA加尾信号，避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40-60%，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins等原则优化基因，并消除内部酶切位点。

所述优化的漆酶ClLACI的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

所述优化的漆酶ClLACI的核苷酸序列编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2所示。

本发明按照毕赤酵母偏爱密码子对原始的LlLAC进行改造，改造后的基因序列与原序列（GenBank: AB055709.1）同源性为76.3%（参见图1），其编码的蛋白质共567个氨基酸。

将基因片段与T/A克隆载体相连（Takara），4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中，获得阳性克隆。抽取该阳性克隆质粒，经Bam H1和Sac 1双酶切后，通过T4 DNA连接酶与毕赤酵母表达载体pPIC9K（invitrogen）连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因的重组质粒pPIC9K-ClLACI（参见图2）。

利用电击法将上述pPIC9K-ClLACI质粒转入毕赤酵母GS115菌中，筛选到的阳性菌株经1wt%甲醇摇瓶诱导48 h后，上清中表达量达到0.017 mg/mL。最适pH为3.6~4.0，在pH 3.6~7.0范围内比较稳定。最适反应温度为40℃。在介体（ABTS: 2,2’-联氨-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐）存在的条件下，能有效脱色染料孔雀绿与结晶紫。

有益效果：

本发明按合成的ClLACI基因可以在毕赤酵母中表达出漆酶，在造纸、纺织、生物合成、废水处理等诸多领域有广泛的应用潜力。

附图说明

图1为ClLACI和原始ClLAC基因序列比对：wt 为原始基因；y为优化的ClLAC基因。

图2为用于毕赤酵母表达的pPIC9K-ClLACI载体。

图3为该酶的最适温度。

图4为该酶的温度稳定性。

图5为该酶的最适pH。

图6为该酶的pH稳定性。

图7为漆酶对染料孔雀绿与结晶紫的脱色效果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步阐述本发明。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明实施中未注明的实验方法，如连接、转化、相关培养基的配制等参照分子克隆实验指南第三版（黄培堂等译，中国，科学出版社，2002）和毕赤酵母表达手册（invitrogen）中方法进行。未注明的化学药品为分析纯级，购自上海国药集团有限公司。

实施例 1

ClLACI基因在毕赤酵母中的分泌表达

一、毕赤酵母表达载体的构建