[发明专利]一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法在审
| 申请号： | 201410593852.6 | 申请日： | 2014-10-30 |
| 公开（公告）号： | CN104404029A | 公开（公告）日： | 2015-03-11 |
| 发明（设计）人： | 蒋国成;陈旭;陈刚;佟勇 | 申请（专利权）人： | 依科赛生物科技（太仓）有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 上海卓阳知识产权代理事务所(普通合伙) 31262 | 代理人： | 马伟 |
| 地址： | 215434 江苏省苏州市*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 甲基化 环状 dna 分子 突变 方法 | ||
1.一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA：以甲基化环状DNA为模板，使用带突变位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增；
b）将步骤a）的PCR产物使用限制性内切酶Dpn I消化，去除甲基化模板；
c）将步骤b）中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。
2. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤a）中，所述的高保真的耐热DNA聚合酶为Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。
3. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤a）中，所述的高温DNA连接酶为Taq DNA Ligase 连接酶或9°N DNA 连接酶。
4. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，所述的高保真的耐热DNA聚合酶与高温 DNA 连接酶的添加比例为：酶活力单位比1：60。
5. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，所述的突变引物是以甲基化环状DNA为模板设计的单条引物，在突变位点前后各保留16~20个与模板配对的碱基。
6. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤b）中，使用限制性内切酶Dpn I消化的时间为5分钟至过夜。
7. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤c）中，所述的消化产物是直接转入感受态细胞中。
8. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，PCR反应的体系中还包含反应缓冲液、GC反应缓冲液、dNTP、ATP、NAD+。
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