[发明专利]一种基于甲基化环状DNA分子的突变试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种基于甲基化环状DNA分子的突变试剂盒及其应用。 

背景技术

体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，是探索启动子调节位点的有效手段，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。 

对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，进而改变蛋白质的功能。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等方面。目前定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变、盒式突变。 

寡核苷酸引物介导的定点突变，首先要把含有待突变的DNA片段克隆到M13噬菌体载体中。M13噬菌体的正链可以去感染具有性纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而留存在噬菌体内的则是双链状态的复制性M13，受M13感染的细菌生长减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。将目的DNA插入到复制型M13的多克隆位点上，去转染细菌，提取单链DNA作为突变的模板。根据需要合成带有突变核苷酸序列的寡聚核苷酸引物，使之与带有目的DNA的单链M13模板杂交，然后加入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸，使杂交上的突变引物得以延伸，并用DNA连接酶使新合成的DNA成环，再去转染细菌。可用DNA序列分析方法从得到的噬菌体中筛选出带有突变DNA相应的片段，从而得到完整的DNA突变体。 

PCR介导的定点突变是利用四种引物，进行三轮的PCR反应，其中头两轮分别扩增出彼此重叠的DNA片段，第三轮PCR使这两条片段融合起来。它在前两轮的PCR中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，两者在其重叠区段具有相同的突变。由于具有重叠的序列，所以在去除了未参入的多余引物后，这两条双链DNA片段经变性和退火处理，便可能形成两种不同形式的异源双链分子。其中一种具5^，凹陷末端的双链分子，不能作为TaqDNA聚合酶的底物；另一种具有3^，凹陷末端的双链分子，可通过TaqDNA聚合酶的延伸作用，产生出具两重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三轮PCR扩增，偏可产生出一种突变位点远离片段末端的突变体DNA。 

盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当它们退火时，按设计要求产生克隆需要的粘性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。 

三种方法各有优点，寡核苷酸介导的方法保真度高；PCR介导的方法操作简单，突变成功率高；盒式方法简单易行，突变效率高。但它们也各自存在着很大的缺点，寡核苷酸介导的方法操作复杂，周期长；PCR介导的方法后续工作复杂，TaqDNA聚合酶保真性低；盒式方法需合成多条引物成本高，受到酶切位点的限制。 

综上所述，亟需一种操作简单、保真性好，且能实现一步多点突变的方法和试剂盒，但是目前关于这种方法和试剂盒还未见报道。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于甲基化环状DNA分子的定点突变试剂盒。 

本发明再一的目的是，提供所述的试剂盒的应用。 

本发明另一的目的是，提供所述的试剂盒的使用方法。 

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是： 

一种基于甲基化环状DNA分子的定点突变试剂盒，所述的试剂盒包含：甲基化环状DNA，带突变位点的突变引物，高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶，限制性内切酶Dpn I，感受态细胞。

所述的高保真的耐热DNA聚合酶为Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。 

所述的高温DNA连接酶为Taq DNA Ligase 连接酶或9°N DNA连接酶。 

所述带突变位点的突变引物是以甲基化环状DNA为模板设计的单条引物，在突变位点前后各保留16~20个与模板配对的碱基。