[发明专利]一种快速检测登革病毒的分子信标探针、引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于体外生物医学诊断技术领域，尤其涉及一种荧光分子信标PCR检测技术。

背景技术

登革病毒（Dengue virus，DEN）属黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒，依抗原性不同分四个血清型，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播，引起登革热、登革出血热和登革休克综合征。登革热流行于热带和亚热带地区，每年约有5000万～1亿人感染，已成为严重的全球公共卫生问题。

分子信标（Molecular Beacon）技术是由Tyagi等1996年首先提出来的，分子信标是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移（FRET）现象设计的。当一个荧光分子（供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子）的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减，这种现象即是荧光FRET，FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为 7～10nm时即可发生FRET，随着距离延长， FRET呈10⁶比例显著减弱。分子信标具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别性强、操作简单以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点已广泛地应用于实时监测聚合酶链反应、基因突变的快速分析、DNA和RNA的检测等领域。登革病毒分子信标PCR荧光定量技术正是基于这样的原理设计的，该技术为登革病毒感染的早期诊断、大规模筛查、临床治疗动态分析、新药开发等提供良好的技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测登革病毒的分子信标探针、引物及检测方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的登革病毒荧光分子信标PCR检测方法，其特征在于选取登革病毒 3’-UTR区保守序列作为RT-PCR扩增反应的靶序列，设计合成特异性的引物和分子信标探针，对登革病毒进行定量检测。

在所述的一种登革毒荧光分子信标PCR检测方法中设计合成了以下引物和分子信标探针：

其中引物为:

DEN-F：5'-AGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCC－3'

DEN-R：5'-CGTTCTGTGCCTGGAATGAT－3'

其分子信标探针DEN-P为：

5'-FAM-CAGCGACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCACGCTG-Dabcyl-3'。

所述的一种登革毒荧光分子信标PCR检测方法其能对人血清中登革病毒进行定量检测。

在所述的一种登革毒荧光分子信标PCR检测方法中的RT-PCR扩增反应：

逆转录反应体系为：包括5×AMV Buffer 4μL，10mmol/L dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）2μL，50μmol/L Random Primer（随机引物）0.5μL，Rnase Inhibitor 0.5μL，AMV（逆转录酶）1μL，RNA Sample 10μL，补水至20μL，反应参数：25℃10min，42℃1h；

荧光PCR反应体系为：2×Hotstart Fluo-PCR mix（2×荧光PCR反应混合液）25μL，25μmol/L DEN-F/DEN-R各1μL，25μmol/L DEN-P 0.5μL，cDNA 2μL，补水至50μL，反应参数：94℃4min；94℃30sec，60℃30sec，72℃34sec，40cycles。

在本发明所述的一种登革毒荧光分子信标PCR检测方法中所用的引物和分子信标探针：

其中引物为:

DEN-F：5'-AGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCC－3'

DEN-R：5'-CGTTCTGTGCCTGGAATGAT－3'

其分子信标探针DEN-P为：

5'-FAM-CAGCGACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCACGCTG-Dabcyl-3'。

本发明所述的一种登革毒荧光分子信标PCR检测的试剂盒，其特征在于：包括上述的引物和分子信标探针。