[发明专利]肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒制备及应用

说明书

技术领域

本发明属于病原生物学检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

手足口病是全球性传染病，近年来已经成为严重威胁儿童健康的传染病之一。其以发热和手、足、咽等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡，重症患儿病死率在10%-25%。

手足口病主要由肠道病毒属的柯萨奇病毒(Cox，A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5、13型)、埃可病毒(Echo) 和EV71引起，其中以EV71及CoxA16型最常见。而EV71感染引起重症病例较为常见。我国自1981年在上海始见本病，之后多个省市区均有报道。2008年5月2日我国正式将手足口病列为丙类传染病进行法定传染病管理。

病毒从咽部或肠道侵入，在局部黏膜或淋巴组织中繁殖，并由局部排出，此时可引起局部症状。继而病毒又侵入局部淋巴结，并由此进入血液循环导致第一次病毒血症。病毒经血循环侵入网状内皮组织、深层淋巴结、肝、脾、骨髓等处大量繁殖并由此进入血液循环，引起第二次病毒血症。病毒可随血流进入全身各器官，如中枢神经系统、皮肤黏膜、心脏等处，进一步繁殖并引起病变。易感者感染EV71后，出现血管变态反应和组织炎症病变。当病毒累及中枢神经系统时，组织炎症较神经毒性作用更加强烈，中枢神经系统小血管内皮最易受到损害。细胞融合、血管炎性变、血栓形成可导致缺血和梗死。在脊髓索、脑干、间脑、大脑和小脑的局部组织中，除嗜神经性作用外，还存在广泛的血管周围和实质细胞炎症。患儿感染EV71后临床表现多样，从隐形感染、普通手足口病到中枢神经系统感染等重症，部分重症患者病情进展较快，甚至死亡。患者主要为学龄前儿童，尤以3 岁以下儿童发病率高。与其他肠道病毒引起的手足口病相比，由EV71 感染引起的疾病发生重症感染的比例相对较高。同时，由于肠道病毒传染性强，易引起暴发或流行。加强对EV71 感染的防控，已成为我国病毒性传染病管理工作的目标之一。

目前对于EV71感染性疾病尚无特效的药物，主要采用对症及支持治疗，积极防止并发症发生。加强疾病及病原的监测、准确及时处置疫情、展开健康教育等是控制EV71流行的关键。EV71疫苗正在开发当中，将成为预防的关键。对人群特别是婴幼儿群体的EV71的血清流行病学状态和规律进行研究，可为手足口病的免疫规划的制订提供数据参考。因此EV71的抗体快速检测试剂盒的开发显得尤为必要。

而相关疫苗的开发及病毒抗原快速检测试剂盒的研制则是预防控制该病的关键。目前检测肠道病毒之方式除了传统的病毒培养鉴定法外，国内已有生物科技公司利用生物芯片技术研发出“肠道病毒鉴定芯片”（EV typing chip），可快速检测出肠病毒之型别，不致延误病患就诊治疗的首要时机。因肠道病毒鉴定芯片感染易引起并发症，且往往在一星期内即转成重症，所以若能提早确知所感染的病毒类型，即可掌握对症治疗的第一时间。肠道病毒鉴定芯片鉴定芯片主要是针对并发症较严重之EV71、Cox A15、Cox A16及Cox B3等几型肠道病毒鉴定芯片所设计出的生物芯片，利用肠道病毒鉴定芯片的特定基因序列来鉴别肠道病毒鉴定芯片的类型。在我国公共卫生系统，出现手足口症状的患儿样本，咽拭子或肛拭子采样后，用探针标记的Real-time PCR进行肠道病毒检测。

目前已经研发出针对肠道病毒IgG、IgM抗体以及检测病毒病毒粒子的的ELISA试剂盒。中国医学科学院医学生物学研究所公开了“EV71型病毒抗原的检测方法”专利（申请号200910094972.0），该专利是采用酶联免疫的方法来检测EV71 抗原。北京科兴生物制品有限公司公开了“EV71 病毒中和表位抗原检测试剂盒或试剂及其制备方法”专利（申请号200910131382.0），该专利提供了一种采用具有光谱性活性的HD6单克隆抗体对EV71病毒抗原进行定量检测的方法。以上均是采用酶联免疫的方法来检测EV71抗原，适用于临床诊断，由于检测时间较长且需要借助专业仪器设备，价格昂贵，操作步骤繁琐费时，且需要洗板机，排枪，酶标记等昂贵仪器，不适合在普通的乡镇医疗机构推广使用。湖南康润药业有限公司公开了“肠道病毒71型胶体金检测试纸条及其制备方法和应用”专利（申请号201210151666.8），该专利是采用胶体金标记的方法来检测EV71抗体，方法简单快捷，但是成本高，不利于大规模的血清流行病学调查结果。

发明内容