[发明专利]长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用方法。 

背景技术

鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，其中抑癌基因的失活与癌基因的激活发挥了关键的作用。 

TP53基因(编码p53蛋白)自1979年被克隆以来，一直是肿瘤分子生物学研究领域最引人注目的重要抑瘤基因之一。大量的证据表明，TP53基因通过调控一系列信号转导通路广泛参与了多种恶性肿瘤的发生发展。在细胞受到各种致癌因素的刺激时，p53蛋白激活并通过转录调控下游关键靶基因的表达，阻滞细胞周期、诱导细胞分化、启动细胞衰老及凋亡、参与DNA损伤修复维持基因组的稳定、调节能量代谢和抑制肿瘤血管生成，从而阻止肿瘤的发生发展。已有的研究发现，TP53基因是包括鼻咽癌在内的多种恶性肿瘤中最常见的突变基因之一，33％～76％的患者存在TP53基因异常。因此，恢复鼻咽癌中TP53基因功能或逆转其下游信号通路，对鼻咽癌的治疗具有重要的意义。 

长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过200nt、缺少特异完整的开放阅读框、无或很少有蛋白编码功能的RNAs分子。最近的研究表明，lncRNAs通过在表观遗传、转录和转录后水平广泛调节基因的表达，它们参与了生物体生长、发育、衰老及死亡等重要生命活动的调控。越来越多的研究表明lncRNAs的异常表达或功能缺失与肿瘤的发生发展密切相关。一些lncRNAs分子在肿瘤的诊断和治疗方面具有重要的意义，且可以作为肿瘤预后判断新的分子标记。目前，已经克隆的人类lncRNAs基因已超过4万多个，但绝大部分lncRNA的功能未知。 

为了寻找鼻咽癌中TP53基因调控的下游lncRNAs及其在鼻咽癌中的应用价值，我们在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因，收集不同时间点的细胞用新一代lncRNAs芯片检测了已知 lncRNA的表达水平。芯片检测的结果显示，lncRNA LOC401317的表达差异最显著，其表达明显上调，提示LOC401317可能具有抑瘤基因的作用。 

我们构建了表达LOC401317的真核表达载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统和裸鼠移殖瘤体内模型中均证实lncRNA LOC401317可明显抑制鼻咽癌细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的生长，因此LOC401317是一个新的抑瘤性lncRNA。将LOC401317真核表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒，可保护LOC401317载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。 

进一步地，我们检测了LOC401317在临床离体肿瘤样本中的表达水平，并分析了LOC401317表达水平与临床病例资料的相关性。我们从鼻咽癌及相对应的正常对照组织中抽提RNA后通过逆转录，实时定量PCR，检测了LOC401317的表达情况，结果显示LOC401317在鼻咽癌组织中表达下调。我们随后又利用原位杂交的方法，进一步在存档石蜡样本验证了LOC401317在鼻咽癌中表达显著下调，因此针对LOC401317的检测制剂可用于鼻咽癌的辅助诊断，结合临床回访资料进行生存曲线分析发现LOC401317表达低的患者其生存时间短于该lncRNA表达高的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后判断。 

发明内容

本发明的目的是提供长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用方法，利用长链非编码RNA LOC401317序列可以制备用于鼻咽癌辅助诊断或者预后预测的制剂。 

lncRNAsLOC401317的应用方法，用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂，该长链非编码RNA LOC401317的序列见SEQ NO:1。 

所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂为原位杂交检测试剂。 

所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测LOC401317表达的寡核苷酸探针，序列如下： 

LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’ 

LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’。 

所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。