[发明专利]一种复合菌制剂及其应用

说明书

技术领域

本发明属于益生菌筛选制备技术领域，具体涉及一种复合菌制剂及其应用。

背景技术

人类面临人口、资源、环境三大问题，开发利用海洋已成为沿海各国的国家战略。随着海洋捕捞资源的急剧衰减，海水养殖已成为国际社会为满足人类日益增长的蛋白质需求普遍采纳的主要举措。发展可持续的水产养殖已成为世界共同关注的主题，水产养殖产品作为高品质蛋白来源已得到国际社会的广泛认同和肯定。作为世界水产品生产大国，中国水产养殖总产量占全世界总产量的70％以上，连续多年居世界首位，对外贸易占农产品出口净收入的50％以上，出口额连续多年居大宗农产品首位。

近年来，病害问题已成为限制海水养殖业持续发展的重要因素，造成了重大的经济损失，而且逐年攀升。每年养殖对虾、鱼类的病害造成了百亿元以上的经济损失，而盲目使用药物等造成了养殖环境恶化和沿海环境污染。残留药物不仅威胁国民健康，也严重影响水产品的出口创汇。人们逐渐开始从生态平衡的角度制定新的水产健康养殖方案，益生菌的使用就是其中重要的措施之一。

水产养殖动物肠道不仅是饲料消化和营养吸收的场所，也是动物机体免疫防御的关键部位。改善动物肠道微生物的群落结构对于提高饲料营养价值和利用效率，增强动物抗病力意义重大。有益微生物水产养殖动物肠道中的作用效果包括：形成有益微生物屏障、增加饲料的消化和利用、分泌抗菌素、刺激和活化免疫系统、与病原微生物的生存竞争等。但目前对虾养殖生产中应用的芽孢杆菌菌株较少，且存在着菌种生物学性状平平，活菌数量偏低，作用效果不稳定等不足，特别是还没有抗对虾病毒病菌株的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种复合菌制剂及其应用，即来源于对虾消化道的地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的复合菌株制剂，上述菌株组合使用可增强对虾细胞和体液的免疫水平，特别是提高对虾抗病毒感染能力。

本发明的复合菌制剂，包括有地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)LV005菌株、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV012菌株和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LV023菌株。

地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)LV005菌株于2013年6月16日在武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M 2013262。

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV012菌株于2013年6月16日在武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M 2013263。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LV023菌株于2013年6月16日在武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M 2013264。

其中混合菌液中，活菌总浓度≥10⁹CFU/mL；且地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌优选为1：1：1。

本发明的复合菌制剂，是将地衣芽孢杆菌LV005发酵菌液、短小芽孢杆菌LV012发酵菌液、枯草芽孢杆菌LV023发酵菌液混合后制备的。

其中地衣芽孢杆菌LV005发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液OD600值达到1.5～1.7时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中地衣芽孢杆菌LV005活菌浓度≥109CFU/mL。

地衣芽孢杆菌LV005的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，1.5％；酵母粉，0.4％；蔗糖，1.0％；氯化钠，2.5％；磷酸高铁，0.001％；硫酸镁，0.02％；硫酸锰，0.05％。

短小芽孢杆菌LV012发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液OD600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中短小芽孢杆菌LV012活菌浓度≥10⁹CFU/mL。